Helicobacter-stimüle B (Hstim-B) hücreleri ile dendritik hücreler arasındaki fonksiyonel etkileşim

Helicobacter pylori (H. pylori) ilk olarak Robbin Warren ve Barry Marshall tarafından tanımlanan mikroaerofilik, spiral şekilli ve gram negatif bir bakteridir. Dünya populasyonun yaklaşık yarısından fazlası bu bakteri ile enfekte durumdadır; fakat, enfekte bireylerin sadece %10-20'sinde ciddi gastrointestinal hastalıklar gözlenmektedir. Geriye kalan enfekte bireylerde semptom vermeyen gastrit gözlenmektedir. H. pylori mide kanserine neden olabilen bir bakteridir; dolayısıyla, Dünya Sağlık Örgütü tarafından tip-1 karsinojen olarak sınıflandırılmıştır. Farelerde H. pylori'ye karşı etkin bir immün yanıt oluşmadığından; fare hastalık modelinin oluşturulmasında Helicobacter felis (H. felis) kullanılmaktadır. İlk olarak Steinmann tarafından tanımlanan dendritik hücreler (DC), antijen sunan hücrelerden biridir ve yabancı antijenlere karşı spesifik immün yanıt oluşturulmasında etkili olduklarından doğal ve kazanılmış immün yanıt arasındaki bağlantının oluşturulmasında önemlidir. Regülatör dendritik hücreler IL-12 ve eşuyarıcı proteinleri (CD40, CD80 ve CD86 gibi) düşük düzeyde eksprese ederken PD-L1, CD95L ve indolamin 2,3 dioksijenaz (IDO) gibi baskılayıcı molekülleri yüksek düzeyde eksprese ederler. Öte yandan, olgun olmayan DC'lerin yanı sıra CD11c+MHCIIyüksekCD80/CD86yüksekIL-12-TNF-α-IL-10+ fenotipine sahip olan yarı olgun DC'lerin tolerojenik rollerinin olduğu düşünülmektedir. B hücreleri, antikor üretimi ve antijen sunmak gibi efektör görevlerinin yanı sıra immün sistemin regüle edilmesinde önemli role sahiptir. B hücrelerinin regülatör özellikleri, B hücrelerden yoksun farelerin otoimmün ensefalopati hastalığının üstesinden gelememeleri sonucu ortaya çıkmıştır. H. felis, B hücrelerini TLR2 ve MyD88 aracılığıyla aktive eder ve tip-1 regülatör T (Tr1) benzeri hücrelerin farklılaşmasını indükleyerek immün yanıtı in vivo ve in vitro'da baskılar. Bu baskılama hastalığın iyileşmesinde arttırıcı etki gösterirken bakterinin mide mukozasında kronik bir biçimde bulunmasına neden olmaktadır. Dolayısıyla, regülatör ve efektör immün yanıt arasındaki denge enfeksiyonun nasıl sonuçlanacağını belirleyebilmektedir. H. felis-aracılı B hücre aktivasyonu sonucunda IL-10 üreten IL-10+ B hücreleri ve TGF-β üreten IL-10- B hücreleri olmak üzere iki farklı B hücre alt grubunun farklılaştığı laboratuvarımızdaki önceki çalışmalar ile gösterilmiştir. Bu çalışmadaki ilk amaç, H. felis'in fare kemik iliği kökenli DC'ler üzerine olan etkilerini belirlemektir. İkinci amaç ise, Helicobacter felis-stimüle B (Hfstim-B) hücrelerinin kemik iliği kökenli DC'ler (BM-DCs) üzerine etkilerini araştırmaktır. Bu deneylerin gerçekleştirilmesi için; C57BL/6 farelerden alınan kemik iliği hücreleri IL-4 ve GM-CSF varlığında olgun olmayan DC'lere farklılaştırılmıştır. B hücreleri ise, C57BL/6 farelerin dalaklarından manyetik ayırım aracılığıyla izole edilmiştir. Daha sonra, IL-10+ B ve IL-10- B hücre alt gruplarının yine manyetik ayırım ile elde edilebilmesi için, B hücreleri H. felis sonikatı ile muamele edilmiştir. IL-10+ B ve IL-10- B hücre alt gruplarının manyetik ayırım yöntemiyle izolasyonunun ardından; hücrelerin salgıladıkları moleküllerin elde edilebilmesi için bu hücreler H. felis sonikatı ile uyarılmıştır. Salgıladıkları molekülleri içeren medyumun DC'ler üzerine uygulanmasından sonra hücreler yıkanmış ve BM-DC'ler LPS veya H. felis sonikatı ile muamele edilmiştir. DC'lerin sitokin profilleri ve aktivasyon durumları protein ve gen düzeyinde belirlenmiştir. Bununla beraber, DC'lerin fonksiyonel analizleri için DC'ler naif CD4+ T hücreleri ile 1:2 oranında (DC:T) 10 ng/ml IL-2 and 1 µg/ml anti-CD3Ԑ varlığında kültürde tutulmuştur. Daha sonra, farklı gruplardaki IL-10 salgılayan CD4+ T hücrelerinin oranları akan hücre ölçer analizleri ile belirlenmiştir. H. felis, DC'lerden IL-12/IL-23 (p40), IL-1β, TNF-α ve IL-10 salgılamalarını indüklemiştir. Bununla uyumlu olarak, IL-12/IL-23 (p40), TNF-α, IL-10 ve IL-6'nın gen ifade düzeyleri indüklenmiştir. Ayrıca, akan hücre ölçer analizleri H. felis'in DC'lerin CD86 ifadesindeki artış ile aktive ettiğini göstermiştir. IL-10+ B ve IL-10- B hücreleri de dahil olmak üzere Hfstim-B hücre grupları, herhangi bir antijenik uyarımın yokluğunda DC'lerin CD86 ifadesini indüklemiştir. Fakat, IL-10+ B hücre salgıları ile uyarılan ve IL-10- B hücre salgıları ile uyarılan DC'ler arasında CD86 ifadesi açısından anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Bununla beraber, Hfstim-B, IL-10+ B ve stimüle edilmeyen B hücrelerinin salgıları ile uyarılan DC'lerde LPS veya H. felis sonikatı ile muamelenin ardından kontol grubuna göre IL-10 salgılanması farklılık göstermemiştir. Fakat, LPS ile muamele edilen grupta IL-10- B hücre salgıları ile uyarılan DC'lerde IL-10 salgılanması azalmıştır ve ayrıca LPS veya H. felis ile muamele edilen gruplarda, IL-10+ B hücre salgıları ile uyarılan DC'lerin IL-10- B hücre salgıları ile uyarılan DC'lere göre daha fazla IL-10 salgıladıkları gözlenmiştir. Bütün Hfstim-B hücre gruplarının salgıları DC'lerden IL-12 salgılanmasını aynı oranda indüklerken; LPS veya H. felis ile muamele edilen gruplarda TNF-α salgılanmasında baskılanma gözlenmiştir. Hfstim-IL-10+ B hücre salgıları ile uyarılan ve sonradan LPS veya H. felis sonikatı ile muamele edilmeyen DC'ler olgun olmayan kontrol DC grubu ile benzer oranda IL-10 üreten CD4+ T hücrelerinin farklılaşmasını sağlamıştır. Ayrıca, önceden stimüle edilmeyen B hücreleri, Hfstim-B hücreleri veya Hfstim-IL-10- B hücreleri ile kültürde tutulup ardından LPS ile muamele edilen DC gruplarında sadece LPS ile muamele edilen DC'lere göre daha az IL-10 üreten CD4+ T hücreleri gözlenmiştir. B hücre salgılarıyla stimüle edildikten sonra H. felis sonikatı ile muamele edilen DC gruplarında IL-10 salgılayan CD4+ T hücre oranları açısından bir fark gözlenmemiştir. Dolayısıyla, IL-10'a ek olarak farklı Hfstim-B hücre altgruplarının salgıları ile uyarılmış DC'lerden üretilen başka faktörler IL-10 üreten CD4+ T hücrelerinin farklılaşmasında etkili olmaktadır. Bu analizlere ek olarak, hücreler arasındaki direkt etkileşimin rolünün değerlendirilmesi için olgun olmayan fare kemik iliği kökenli DC'ler Hfstim-B hücreleri ile 1:1 ve 1:2 oranında (DC:B) kültürde tutulmuştur ve sonrasında LPS ve H. felis sonikatı ile muamele edilmiştir. Hfstim-B hücreleri ve olgun olmayan DC'ler arasındaki hücreler arasındaki direkt etkileşim DC'lerin CD86 ekspresyonlarını arttırarak DC'leri aktive etmektedir. B hücreleri tek başına DC'lerin IL-10 ve TNF-α salgılamalarını indüklememektedir. Fakat, 1:1 oranında kültürde B hücreleri ile etkileşimin ardından, DC'lerin LPS veya H. felis sonikatı ile muamelesi DC'lerin IL-10 salgılamalarının azalmasına neden olmuştur. Bununla beraber, LPS ile muamelenin öncesinde DC'lerin B hücreleriyle 1:2 (DC:B) oranında olacak şekilde tutulması DC'lerin IL-10 üretimini indüklemiştir; bunun tersine, stimüle edilmeyen B hücreleri aynı koşullarda DC'lerin IL-10 salgılamasını baskılamıştır. Ayrıca, LPS veya H. felis sonikatı ile muamelenin öncesinde stimüle edilmeyen veya Hfstim-B hücreleri ile 1:2 (DC:B) oranında etkileşen DC'lerin TNF-α salgılamalarında etkili bir baskılanma gözlenmiştir. Dolayısıyla, DC'ler ile kültürde tutulan B hücrelerinin sayısı, B hücrelerinin DC'ler üzerindeki regülatör etkilerini göstermelerinde etkili bir faktör olabilir. İlginç bir şekilde, Hfstim-IL-10+ B veya Hfstim-IL-10- B hücreleri direkt etkileşimde oldukları DC'lerin TNF-α salgılamalarını etkilememiştir. Dolayısıyla; IL-10'a ek olarak Hfstim-B hücrelerinden salgılanan diğer moleküller direkt hücre etkileşimi ile birlikte DC'lerin aktivasyonu ve fonksiyonu üzerine regülatör role sahiptir. Sonuç olarak; ilk olarak, DC'lerin in vitro'da H. felis antijenlerine yanıt olarak aktive oldukları ve pro-enflamatuvar ve anti-enflamatuvar sitokinleri salgıladıkları söylenebilir. İkinci olarak da; Hfstim-B hücrelerinin olgun olmayan fare kemik iliği kökenli DC'leri IL-10 salgılayan tolerojenik forma dönüştürdüğü önerilmektedir. Bu çalışmada, H. felis antijenlerinin kemik iliği kökenli DC'ler üzerine etkileri ayrıntılı bir şekilde gösterilmiştir. Ayrıca, çalışmamız Hfstim-B hücre alt gruplarıyla kemik iliği kökenli DC'lerin ex vivo ortamdaki etkileşimlerini araştıran ilk çalışmadır.