Sinir doku mühendisliğinde işlevselleştirilmiş nanofiberlerin kullanımı

Omurilik yaralanmaları kalıcı motor ve duyusal hasarlara yol açan tahrip edici travmalardır. Omurilik yaralanmalarının başlıca sebepleri trafik kazaları, spor travmaları, düşmeler ve şiddet eylemleri olarak sıralanmaktadır. Ulusal Omurilik Yaralanmaları Derneği istatistik verilerine göre Amerika'da her yıl 13.400 yeni vaka görülmektedir ve yaralanmalar sonucu oluşan hasarlar, omuriliğin kısıtlı rejenerasyon yetisi nedeniyle çoğunlukla kalıcı hasara dönüşmektedir. Rehabilitasyon ve fizik tedavi gibi bazı destekleyici terapiler bulunmaktadır. Ayrıca halihazırda devam eden klinik araştırmalar bulunmaktadır. Ancak omurilik yaralanmalarına yönelik kesin tedavi henüz ortaya konulmamıştır. Doku mühendisliği stratejileri hasar gören dokularda ve hücrelerde rejenerasyonun ve iyileşmenin sağlanması amacıyla kullanılmaktadır. Bu nedenle hasar gören nöronların rejenere olması ve kopmuş sinir bağlantılarının tekrar kurulmasıyla omurilik hasarlarının tedavi edilmesine yönelik pek çok doku mühendisliği çalışması bulunmaktadır. Doku mühendisliğindeki temel yaklaşım, zarar gören bölgenin, dokunun 3 boyutlu yapısını taklit eden bir iskele yardımıyla desteklenmesidir. Yaralanan dokuda hasar gören hücreleri yenilemek, büyüme faktörlerinin ve ECM proteinlerinin salımı aracılığıyla rejenerasyonu hızlandırmak ve konak hücrelerin onarımlarını teşvik etmek amacıyla bu iskele yapısıyla beraber otojenik, allojenik veya zenojenik hücreler nakledilir. Sinir doku mühendisliğinde, çok farklı doku iskeleleri tasarlanmaktadır, ancak en başarılı sonuçlar mikro- ve nanofiber doku iskelelerinden elde edilmektedir. Bunun sebebi fiber yapıların sinir dokunun doğal yapısına benzer morfoloji göstermesidir. Embriyonik kök hücreler, mezenkimal kök hücreler, Schwann hücreleri gibi birçok hücre tipi de omurilik yaralanmalarının tedavisine yönelik çalışmalarda kullanılmaktadır. Ancak ideal iskelenin elde edilmesi için araştırmalar devam etmektedir. Sinir doku mühendisliğine yönelik iskelelerin yapımı için, farklı biyomateryaller kullanılabilir ve biyobozunur alifatik polyesterler en çok tercih edilen polimerlerdir. PLLA biyobozunur termoplastik alifatik bir polyesterdir ve doku mühendisliği uygulamalarında sıklıkla kullanılır. PBSu da diğer bir biyobozunur termoplastik alifatik polyesterdir ve endüstriyel uygulamalarda kullanımı yaygındır. Ancak PBSu'nun biyomedikal alanda kullanımı oldukça sınırlıdır ve bu alanda uygulamaları görece yenidir. Özellikle sinir doku mühendisliği çalışmalarında PBSu daha önce kullanılmamıştır. Bu çalışmanın amacı, omurilik yaralanmalarında mekanik olarak hasar görmüş nöron ve aksonlarda rejenerasyonu sağlayabilecek yönlendirilmiş ve işlevselleştirilmiş nanofiberlerden ve destekleyici hücrelerden oluşan bir doku iskelesinin oluşturulmasıdır. Amacımıza ulaşmak için, yukarıda bahsi geçen stratejiler birleştirilmiş ve kopan sinirlerin iyileşmesi için kullanılacak bir entegre iskele yapısı tasarlanmıştır. Yapının dış kılıf ve iç matris olmak üzere iki temel kısmı bulunmaktadır. Tasarımımızın dış kılıf kısmının gözenekli silindirik bir yapı olması ve böylece iskelenin bütünlüğünün sağlanması öngörülmüştür. İç kısımda ise yönlendirilmiş nanofiberler kullanılarak doğal sinir dokusunun taklit edilmesi ve nöral bağlantının tekrar kurulması hedeflenmektedir. İskele yapısının taşıyıcı kısımları PLLA ve PBSu polimerlerinin karışımından hazırlanmıştır. Önerilen tasarımın en önemli özelliği yönlendirilmiş nanofiberlerin yüzeylerinin YIGSR sentetik peptide ile işlevselleştirilmesidir. Bu peptidler Laminin-I proteininden türeyen nöroaktif peptid dizileridir ve hücrelerin nöronlara farklılaşması ve hasarlı bölgede rejenerasyonun desteklenmesi için kullanılmıştır. Özellikle mezenkimal kök hücrelerin ekildiği işlevselleştirilmiş ve yönlendirilmiş nanofiberlerin iyileşmeyi hızlandırması, akson uzamasını ve kök hücrelerin farklılaşmasını sağlaması beklenmektedir. Bu çalışmada yönlendirilmiş nanofiberlere kimyasal olarak bağlanan peptidlerin etkileri araştırılmıştır. Tasarlanan iskele yapısında, rejenerasyon potansiyelinin arttırılması için mezenkimal kök hücreler ve Schwann hücreleri birlikte kullanılmıştır. Mezenkimal hücrelerin iç matrisi oluşturan nanofiberlerin üzerine ekilerek, olgun nöronlara dönüşme kapasiteleri ile hasarlı dokunun restorasyonu amaçlanmaktadır. Buna ek olarak ise dış kılıfın iç gözenekli kısmına Schwann hücrelerin ekilmesi ve bu hücrelerden büyüme faktörlerinin salımı ile rejenerasyonun iyileştirilmesi ve mezenkimal kök hücrelerin farklılaşması hedeflenmiştir. Bu çalışmada öncelikle tasarımın dış kısmı PLLA/PBSu polimerlerinden oluşturulmuştur. Farklı karışım oranları seçilmiş ve tuz uzaklaştırma metodu ile polimerik süngerler imal edilmiştir. Üretilen süngerler Taramalı Elektron Mikroskobu ile görüntülenmiş ve yüzeylerin gözeneklilikleri analiz edilmiştir. 120 günlük inkübasyon ile bu süngerlerin in vitro biyobozunma profilleri araştırılmıştır. Farklı karışım oranlarının biyouyumluluklarının değerlendirilmesi için, polimerik süngerler üzerinde Schwann hücreleri büyütülmüş ve in vitro hücre kültürü çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Tüm bu sonuçlar ışığında, en ideal karışım oranı PLLA/PBSu (3%, w/v, 2:1) olarak belirlenmiştir. Tasarımının iç matrisi için, elektroeğirme metodu kullanılarak yönlendirilmiş nanofiberler üretilmiştir. Doku mühendisliğinde kullanılmak üzere PBS polimerinden nanofiberlerin fabrikasyonu için oldukça kısıtlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu nedenle bir çok farklı çözücü ve polimer konsantrasyonu denenmiştir. Nanofiberlerin yapımı için PBSu polimeri PLLA polimeri ile karıştırılmıştır ve elde edilen fiberler Taramalı Elektron Mikroskobu ile görüntülenmiştir. Nanofiberler için in vitro biyobozunma çalışması gerçekleştirilmiştir. Ayrıca yönlendirilmiş nanofiberlerin çekme direnci de Dinamik Mekanik Analiz (DMA) yöntemi ile ölçülmüştür. Yönlendirilmiş nanofiberlerin işlevselleştirilmesinden önce, nanofiberlerin üzerine Schwann hücreleri ekilmiş ve yönlendirilmiş nanofiberlerin biyo-uyumluluğu in vitro hücre kültürü çalışmaları ile araştırılmıştır. Hücre proliferasyonu ölçülmüş ve hücrelerin nanofiberler üzerindeki yerleşimi ve büyümesi Taramalı Elektron Mikroskobu ve Konfokal Mikroskobu ile görüntülenmiştir. Böylece bu çalışmalar ışığında yönlendirilmiş nanofiberlerin Schwann hücrelerinin iskele yapısı üzerinde hizalanmasını sağladığı kanıtlanmıştır.Nanofiberlerin karakterizasyonundan sonra, peptidler ile işlevselleştirilmeleri için EDC/NHS çapraz bağlama (cross-linking) yönteminden yararlanılmıştır. Peptidlerin bağlandığını kanıtlamak için, peptidler floresan boya ile işaretlenmiştir. Böylece bağlama işlemi tamamlandıktan sonra, nanofiberler konfokal mikroskobu ile görüntülenerek peptidlerin fiber yüzeyindeki homojen dağılımı görüntülenmiştir. Oluşturulan iskele yapısının rejenerasyonu ve akson uzamasını tetikleme potansiyeli olduğunu kanıtlamak için, sıçan kemik iliğinden izole edilmiş mezenkimal kök hücreler işlevselleştirilmiş nanofiberler üzerine ekilmiştir ve iskele yapısına nöroaktif peptid bağlamanın etkileri in vitro çalışmalar ile araştırılmıştır. Kök hücrelerin iskele yapısı ile biyouyumluluğunu kontrol etmek için MTS hücre büyüme analizi gerçekleştirilmiştir. Kök hücreler floresan nöral işaretleyiciler ile boyanmış ve rMSCs'lerin farklılaşmaları konfokal mikroskopi ile görüntülenmiştir. Ayrıca yine farklılaşma kapasitesinin gösterilmesi için, farklı hedef genlerin mRNA seviyeleri Real Time PCR ile araştırılmıştır. Çalışmanın sonucunda, PLLA/PBSu karışımının hem sünger hem de yönlendirilmiş nanofiberlerin yapımı için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Sinir hücreleri oluşturulan taşıyıcılarla uyum sağlamıştır. Özellikle, nöroaktif peptidlerle aktifleştirilip, mezenkimal kök hücrelerin ekiminden sonra, yönlendirilmiş nanofiberlerin kök hücrelerin sinir hücrelerini farklılaşmasını tetiklediği ve sinir doku hasarları için umut vaadettikleri ortaya konulmuştur. Sonuç olarak, önerilen tasarımın, in vitro araştırılmaların neticesine göre, sinir doku mühendisliğinde tedavi amaçlı kullanılabilecek alternatif bir iskele yapısı olduğu kanıtlanmıştır.