Galium aparine L. bitkisinden peroksidaz ve katalaz enzimlerinin karakterizasyonu

Canlı yaşamı için gerekli olan oksijenin bazı türleri (reaktif oksijen türleri, ROS) insan sağlığı için son derece zararlı olabilmektedir. ROS çoğunlukla serbest radikaller tarafından oluşturulurlar ve moleküler oksijene kıyasla kimyasal olarak daha reaktiftirler. Serbest radikallerin yok edilememesi durumunda; hücre membranında ki proteinler ROS'lar tarafından yıkılarak hücrelerin ölümü, DNA'nın kırılarak mutasyonlara açık hale gelmesi, kanser, yaşlanma ve bağışıklık sisteminin zayıflaması gibi olaylar gözlenebilir. ROS oluşumu ve meydana getirdikleri hasarların önlenmesi için vücut savunma mekanizmaları geliştirirmektedir. Bu savunma sistemlerine antioksidan savunma sistemleri, yani kısaca antioksidanlar ismi verilmiştir. Bitki dokuları ROS'ni ortadan kaldırarak stres koşullarındaki hücreleri korumak için katalaz (CAT), peroksidaz (POD), süeroksit dismutaz (SOD) gibi çeşitli enzimler ve fenolik bileşikler içermektedir. Bu sayede serbest radikallerden etkilenmezler ve meydana getirdikleri hasarı oortadan kaldırmış olurlar. Enzimler, protein yapısında olan ve biyokimyasal reaksiyonları gerçekleştiren biyokatalizörlerdir. Peroksidaz enzimi (EC 1.11.1.7), hidrojen peroksitli ortamda flavonoidler, fenoller, , sülfonoidler, aromatik aminler ve pirogallol gibi birçok substratın oksidasyonunu katalize eden bir oksidoredüktaz grubu enzimidir. POD bitki, hayvan, bakteri ve mantarlarda bulunan, bununla birlikte bitki gelişimi için gerekli olan hücre duvarında da yer alan bir oksidoredüktaz grubu enzimidir. POD enzimleri, H2O2 kullanarak inorganik ve organik substratların oksidasyonunu ve katalize ederler. Katalitik moleküllerin örnekleri; guaiacol, o-dianisidine, pyrogallol, azo boya türevleri, o-fenilendiamin sayılabilir. POD'un bitki savunma mekanizmaları, meyve ve sebzelerde indolasetik asit regülasyonu, hormon aktivitesi ve lignin biyosentezi gibi önemli işlevlerde önemli bir rol oynadığı bildirilmiştir. POD, bitkisel gıdalarda bol miktarda bulunur. Bitkilerde POD çiçeklerde, gövdelerde, yapraklarda, hücre çekirdeklerinde, hücre zarlarında, ribozomlarda ve hücre duvarlarında bulunur. Katalaz enzimi ((CAT): H2O2 oksidoredüktaz E.C.1.11.1.6 doğada çok yaygındır. Hemen hemen tüm aerobik mikroorganizma, bitki ve hayvan hücrelerinde yüksek katalitik aktiviteye sahiptir. Bir katalaz enzimi, oksidoredüktaz grubu olan hidroperoksidazlar sınıfına aittir. Hidroperoksidazlar, substrat olarak hidrojen peroksit ve organik peroksitleri kullanır. Bir katalaz enzim solüsyonu, kontak lens yeniden kullanılmadan önce H2O2'yi ortamdan güvenilir bir şekilde uzaklaştırır. UV ışınları serbest radikallerin oluşumunu hızlandırır. Serbest radikaller ise cilde zarar verir ve cilt kalitesinin bozulmasına neden olur. Antioksidan moleküller çeşitli etkiler gösterir ve oksidasyonun neden olduğu cilt hasarını azaltır. Katalaz enzimi son zamanlarda H2O2 ve enzimlerden oluşan çeşitli yüz maskesi uygulamalarında ve epidermisin üst katmanlarında hücresel oksidasyonu artırarak vitiligo tedavisinde kullanılmaktadır. Yoğurt otu (Galium aparine), Kuzey Amerika, Avrupa ve Asya'ya da yetişen bir tırmanma bitkisidir. G. aparine'nin aktif bileşenleri, alkanlar, flavonoidler, antrakinonlar, polifenolik asitler, tanenler, iridoidler ve C vitaminidir. Lenf şişlikleri, bademcik iltihabı, sarılık, kanser, ateş, ve lösemi tedavisinde kullanılmıştır. Bu çalışmada Sakarya bölgesinde yetişen yoğurt out (Galium aparine L.) bitkisinden peroksidaz ve katalaz enzimleri saflaştırılarak her iki enzimin kinetik özellikleri ve bazı inhibitörlere karşı aktiviteleri tespit edilmiştir. Bu amaçla enzim izolasyonu için pH 7,0, 0,1 M fosfat tamponu, askorbik asit, PVP ve Triton X-100 kullanılmıştır. Bitki -20 ℃'de depolanmıştır. Enzim izolasyon işlemleri +4 ℃'de yapılmıştır. Yoğurt otu bitkisinin izolasyonu gerçekleştirildikten sonra üç fazlı ayırma tekniği (TPP) ile saflaştırılmış ve SDS-PAGE metodu ile enzimlerin molekül ağırlıkları tayin edilmiştir. Peroksidaz enziminin molekül ağırlığı 65 kDa, katalaz enziminin molekül ağırlığı ise 50 kDa olarak bulunmuştur. Peroksidaz enzimi aktivitesi, uygun subsratlar ile 60 sn'de 420 nm'deki absorbasın ölçülmesi sonucu tayin edilmiştir. Katalaz enzimi aktivitesi ise H2O2 substratının 180 sn 240 nm'deki absorbans ölçümü ile tayin edilmiştir. Peroksidaz enziminin 4 metil katekol ve sabit konsantrasyondaki H2O2 substratı için Vmax ile Km değerleri sırasıyla 0,00238 EÜ/dk ve 1,47mM olarak belirlenmiştir. Katalaz enziminin Vmax ile Km değerleri ise 0,0007 EÜ/dk ve 6,41 mM olarak belirlenmiştir. Peroksidaz enzimi substrat spesifikliği testi için H2O2'li ortamda pirogallol, o-fenilendiamin, gallik asit, kafeik asit, 4-metilkatekol substratları ile aktivite ölçümü gerçekleştirilmiştir ve G.aparine peroksidaz enziminin en ilgili substratı 1,086 mM Km değeri ile pirogallol substratı olarak tesit edilmiştir. Optimum pH POD enzimi için 6,5, CAT enzimi için ise 8 olarak belirlenmiştir. G. aparine. peroksidazı ve katalazı için farklı sıcaklıklarda (0-90 ℃) optimum sıcaklık tayini yapılmıştır. Peroksidaz ve katalaz için optimum sıcaklık 30 ℃ olarak bulunmuştur. G. aparine peroksidazı ve katalazı için inhibisyon tayininde inhibitör olarak sodyum azid ve tiyoüre kullanılmıştır. Her iki inhibitöründe POD ve CAT enzimlerini inhibe ettiği sonucuna varılmıştır. Enzim aktivitelerini yarıya düşüren inhibitör miktarını belirlemek için önce % bağıl aktiviteler hesaplanmış ve grafik yardımıyla IC50 değerleri belirlenmiştir. Yoğurt otu peroksidazına tiyoüre inhibisyonu sonucunda IC50 değeri 1,18 mM, sodyum azid inhibitörü ile ise IC50 değeri 2,05 mM olarak hesaplanmıştır. G. aparine katalazına tiyoüre inhibisyonu sonucunda IC50 değeri 0,85 mM ve sodyum azid inhibisyonu sonucunda ise IC50 değeri 0,97 mM olarak belirlenmiştir. G.aparine peroksidazı ve katalaz enzim aktivitelerine Fe(III), Cu(II), Mn(II), Co(II), Ni(II), Ba(II), Ca(II), Pb(II), Hg(II) ve Cd(II) metallerinin etkisi incelenmiştir. 0,5-1 ve 5 mM olarak 3 farklı konsantrasyonda metal çözeltileri hazırlanmış ve aktiviteleri ölçülmüştür. Aktivite tayini peroksdiaz için 420nm, katalaz için 240 nm'de yapılmıştır. % kalan enzim aktiviteleri hesaplanarak metallerin inhibisyon oranları belirlenmiştir. En yüksek oranda POD enzimine inhibisyon etkisi; 0,5 Mm konsantrasyonda Hg(II)'nın % 47,18 oranında, 1 mM Hg (II) de % 84,67 ve 5 mM Hg (II) de ise % 80 oranında olduğu belirlenmiştir. 0,5 Mm konsantrasyonda Pb(II) % 40, 1 Mm konsantrasyonda Cd(II) % 52 ve 5 Mm konsantrasyonda Pb(II) ise % 55 oranında ise CAT enzimini inhibe etmiştir. Ayrıca, G. aparine peroksidazı ve katalazına solvent etkisi test edilmiştir. Solvent olarak aseton, etanol, DMSO, t bütanol ve DMF seçilmiştir. Bu solventlerin % 5- % 30 (v/v) oranlardaki çözeltileri POD ve CAT enzimleri ile inkübe edilmiştir ve enzim aktivite ölçümü uygun substratların varlığında peroksidaz için 420 nm, katalaz için 240 nm' de gerçekleştirilmiştir. % kalan enzim aktiviteleri hesaplanarak karşılaştırma yapılmıştır. POD enzimine solvent etkisi incelendiğinde % 30 oranında etanol ilavesin ve CAT enzimine solvent etkisi incelendiğinde ise %30 oranında DMF ilavesinin enzimin aktivitesini en fazla inhibe eden solvent olduğu belirlenmitir. Enzimlere tuz toleransı testi için 1, 2, 3, 4, 5mM konsantrasyonlarında NaCl çözeltileri hazırlanmıştır. Belirtilen knsantrasyonlardaki tuz çözeltileri ile enzimler 2 saat inkübe edildikten sonra aktivite tayini yapılmıştır. Artan tuz konsantrasyonunda enzimin aktivitesinin düştüğü görülmüştür. G. aparine peroksidazının katalaza göre daha fazla tuztoleransı gösterdiği tespit edilmiştir. Peroksidaz ve katalaz enzimlerinin iyonik şiddet etkisi için 1, 2, 3, 4 ve 5 mM konsantrasyonlu NaCl çözeltileri hazırlanarak aktivite ölçümü gerçekleştirilmiştir. G. aparine peroksidaz enziminin 3 mM NaCl çözeltisi ile en yüksek aktivite gösterdiği görülmüştür. Enzimin 1 mM tuz konsantrasyonunda ise % 42 oranında inhibe olduğu görülmüştür. Katalaz enziminin 3 mM tuz konsantrasyonunda en yüksek aktiviteye sahip olduğu fakat 5 mM konsantrasyonda aktivitesinin % 40'a düştüğü görülmüştür.