Interrogating the function of chromatin modifying enzymes in TRAIL response of GBMs

Glioblastoma multiforme (GBM), çok kısıtlı tedavi opsiyonları olan agresif bir beyin kanseridir. GBM hastalarının yaşam süreleri tanı sonrası 12 ay civarındadır. GBM, invaziv doğasından ve kan beyin bariyerinin (KBB) teröpatik ajanlara karşı limitli geçirgen yapısından dolayı zayıf bir prognoz sergilemektedir. Intrakranial tümörlerin cerrahi rezeksiyonu da güvenlik kaygıları nedeniyle sınırlıdır. Tümör-nekroz-faktör ilişkili apoptoz indükleyici ligand (TRAIL), sağlıklı hücrelere zarar vermeden sadece tümör hücrelerini hedef alarak programlı hücre ölümünü tetiklediği için ümit verici bir teröpatik ajandır. Buna rağmen, TRAIL-bazlı tedavilerde karşılaşılan büyük engellerden biri farklı tümör doku hücrelerinin TRAIL'a karşı farklı duyarlılık göstermeleridir. Tümör hücrelerinin bu yüksek değişken davranışı, TRAIL direncinde farklı seviyelere yol açan, apoptozda rol alan elemanların farklı düzenlenmesinden kaynaklanmaktadır. Ortaya çıkan sonuçlar, TRAIL-direnci ile apoptotik programın temel bileşenlerinin anormal ifadesi arasında bir ilişki olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, bu komponentlerin epigenetik seviyede nasıl düzenlendikleri henüz tam olarak bilinmemektedir. Bütün genlerin transkripsiyon düzeyinde sıkıca kontrol edilmeleri, epigenetik modifiye edici enzimler ile uyum içerisinde çalışan ana transkripsiyon faktörlerinin denetimi altında olduğu için, kromatin modifiye-edici enzimlerin fonksiyonlarını değerlendirmek ve TRAIL yanıtını düzenleyen kromatin-bazlı yeni mekanizmaları tanımlamak amacıyla bir "short-hairpin RNA" (shRNA) taraması gerçekleştirildi. DNA'da ve histon modifikasyon yolağındaki 47 genin rolünü sorgulamak için 2-3 shRNA/gen kullanıldı. Buna dayanarak; DNA-metiltransferazları (DNMTs), Histon-metiltransferazları (HMTs), Metil-DNA bağlayıcı proteinleri ve Polikomb kompleks üyeleri (PrC) test edildi. Birbirinden farklı shRNA'ların enfekte edilmesi ile, U87MG hücrelerinde TRAIL cevabı canlılık deneyleri ile test edildi. Sonuç olarak, sırasıyla bir H3K36-spesifik demetilaz ve bir H2AK119'un E3 ubikitin-protein ligazı olan KDM2B ve RING1A'yı TRAIL cevabında yeni bir düzenleyici olarak tanımlandı. Çalışmalarımızda KDM2B'ye odaklanıldı. Buna göre, KDM2B'nin susturulması TRAIL duyarlılığını, kaspaz-8, kaspaz-3, kaspaz-7 ve kesilmiş PARP'ı anlamlı bir biçimde artırdı. KDM2B susturulmasının apoptotik süreci hızlandırdığı canlı hücre görüntüleme ve gerçek zamanlı hücre analizi deneyleri ile ortaya konuldu. Ayrıca, eş zamanlı olarak KDM2B'nin tersine modifikasyonunun katalizlenmesinden sorumlu metiltransferazların susturulmasının, KDM2B inhibisyonuyla gerçekleşen fenotipi geri döndürdüğü gözlendi. KDM2B tarafından düzenlenen moleküler yolağı deşifre etmek amacıyla, apoptozla ilişkili genlerin ekspresyon seviyelerini RNA-sekanslama ve kantitatif RT-PCR ile test edildi ve KDM2B'nin susturulması ile pro-apoptotik genler olan HRK, DR4 ve kaspaz 7'nin arttığı ve anti-apoptotik gen Mcl-1'in baskılandığı gözlemlendi. İmmün-baskılanmış farelere yapılan deri altı susturulmuş-KDM2B ve kontrol hücre enjeksiyonları da KDM2B'nin tümör büyümesini ve anjiyogenezi anlamlı şekilde etkilediğini gösterdi. Birlikte ele alındığında, bulgularımız GBM hücrelerinde yeni bir mekanizmayı; apoptozun kilit bileşenlerinin KDM2B'nin epigenetik kontrolü altında olduğunu önermektedir. Dolayısıyla, KDM2B'nin doğrudan DNA hedeflerinin belirlenmesi, GBM'lerde apoptoz yanıtının anlaşılmasında ve başarılı bir pro-apoptotik terapi tasarımının yardımında yeni bir anlayış sağlayabilir.