Glioblastoma
85 theses under this subject heading
Lipopolisakkarit ve temozolomid ile muamele edilmiş glioblastoma hücresinde gremlin -1 ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi
Glioblastoma (GB) bilinen en maling beyin tümörüdür. Son yıllarda yapılan çalışmalar gremlin 1'i belirli kanser türlerinde potansiyel bir terapötik hedef olarak göstermektedir. Gremlin 1'in tümör dokularında kanserle ilişkili stromal hücreler tarafından eksprese edildiği ve bu şekilde mikroçevre tarafından regüle edilen tümör büyümesine ve invazyonuna katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Glioblastoma Multiforma'nın kemoterapi tedavisinde sıklıkla temozolomid (TMZ) kullanılır ve anti-tümör etkisi olan tek alkilleyici ajandır. Lipopolisakkarit (LPS) tümör hücrelerini uyaran bir bakteri hücre duvar elemanı olup, gliomalar üzerinde anti-tümör etkisi bulunmaktadır. Bu deneysel çalışmada; U-118 insan glioblastoma multiforme hücre hattı, hücre kültürü ortamında çoğaltılarak, yaklaşık %95 yoğunluk gözlemlendiği gün flasktan hücreler tripsin-EDTA ile kaldırıldı. Hücre süspansiyonu hazırlanarak 60 mm2lik petrilere hücreler eklenerek çoğalması beklendi. İstenilen yoğunluğa ulaşan hücrelere 200 µM, 100µM, 50 µM, 25 µM konsantrasyon aralıklarında TMZ ve 10 µg/ml, 1 µg/ml, 0,1 µg/ml, 0,01 µg/ml konsantrasyon aralıklarında LPS uygulandı. 24 saat ve 48 saat inkübasyon sürelerinin hemen ardından protein izolasyonu yapıldı. Gremlin 1 protein düzeyleri sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve Western blot ile analiz edildi. Çalışmamızda, 24 saat 25 ve 50 µM konsantrasyonlarda TMZ muamele edilen glioblastoma hücre hatlarında Gremlin-1 ekspresyonlarında artış ve 24 saat 0.1 µg/ml konsantrasyonda LPS uygulanan glioblastoma hücrelerinde gremlin-1 ifadesi seviyelerinde bir azalma gösterdik. Bu bulgular glioblastomada gremlin-1 düzeylerinin önemli bir rol oynadığına işaret etmektedir. Glioblastoma tümörlerinde direnç gelişme sıklığı ve sağ kalım süresinin kısalığı düşünüldüğünde gremlin-1'in etkinliğinin araştırılmasının oldukça önemli sonuçlar ortaya çıkarılabileceği kanısındayız.
Glioblastomada melatoninin hücresel düzeyde antiepileptik etkisinin incelenmesi
Nöbetler primer beyin tümörlerinin iyi bilinen bir semptomudur ve antikonvulzan kullanımı oldukça yaygındır. Glioblastoma ve tümörle ilişkili epilepsi santral sinir sistemindeki ana eksitatör nörotransmitter olan glutamatın oynadığı kritik rol ve birkaç patofizyolojik mekanizma ile birbiriyle yakından ilişkilidir. Glutamat, sistein/glutamat antiporter çözünen taşıyıcı ailesi 7 üye 11 (SLC7A11) yoluyla glioblastoma hücreleri tarafından salınır. Glioblastoma hücrelerinde SLC7A11 ekspresyonu artışı ile birlikte nöbet ilişkisinin olduğu bildirilmektedir. Melatoninin ise antioksidan, antieksitotoksik, antineoplastik ve antiinflamatuar etkilerinin olduğu gösterilmiştir. Epilepside antiepileptik özellik gösterebileceği düşünülmektedir. Nöbetle birlikteliği oldukça sık görülen glioblastomada melatoninin antikonvulzan etkisine dair literatürde çalışma izlenmemiş olup bu çalışmada in vitro olarak glioblastoma hücre hattına melatonin uygulaması sonucunda hücre canlılığına ve glioblastomada nöbet aktivitesiyle ilişkili olan SLC7A11 proteini üzerine etkisi incelenmiştir. Tümör olmayan hücrelerdeki etkisiyle kıyaslamak amacıyla astrosit hücre hattı kullanılmıştır. Hücre canlılığına etkisi koloni sağkalım deneyleri ile değerlendirilmiştir. Melatoninin glutamaterjik yolaktaki etkisi ise Western Blot yönteminde SLC7A11 proteini çalışılarak incelenmiştir. 24, 48 ve 72 saat 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 M melatonin uygulanan hücre gruplarında, 72 saat 10-3 M melatonin uygulamasının glioblastoma hücrelerinde sağkalımı %50'den fazla azalttığı saptanmıştır. Glioblastoma ve astrosit hücrelerinde melatonin uygulaması ile SLC7A11 proteinininde Western Blot analizi sonucunda kontrole göre azalma izlenmemiştir. Glioblastomada melatoninin süre ve konsantrasyona bağımlı olarak hücre sağkalımına etki etmesi antineoplastik etkisini desteklemektedir. Melatoninin glioblastoma hücrelerinde, glutamat ve ferroptoz mekanizmasında yer alan SLC7A11 proteini üzerine olan etkisinin ise ilk kez bu çalışma ile incelenmesi gelecek çalışmalar için yol gösterici olacaktır. Anahtar kelimeler: Glioblastoma, Epilepsi, SLC7A11 proteini, Melatonin
Glioblastom tedavisinde ileri yaklaşım: Tümör mikroçevresine duyarlı ve dual etkili nanopartiküler sistemlerin radyoterapinin etkinliğini artırmak için tasarlanması ve değerlendirilmesi
Glioblastom hızlı proliferasyon, yüksek invazyon gibi özellikleri nedeniyle en agresif beyin tümörlerindendir. Bu tez çalışması kapsamında, radyoterapi ve kemoterapi yaklaşımlarının birlikte kullanılarak glioblastomun (GBM) etkin tedavisini sağlamak üzere; scFvEGFR ile tümöre hedeflendirilmiş, radyoterapinin etkinliğini artırmak üzere Perflorokarbon içeren, radyoterapi sonrası GBM hücrelerinde meydana gelecek hasarın onarılmasını engellemek üzere talazoparib (TLZ) yüklenmiş poli(laktik-ko-glikolik asit (PLGA) nanopartikül formülasyonları tasarlanmış, hücre kültürü ve tümör geliştirilmiş deney hayvanları üzerindeki etkinliği değerlendirilmiştir. TLZ içeren metil selüloz nanokapsüllerinin (MSN) ve PLGA nanopartiküllerin hazırlanması için çözücü ekstraksiyon ve evaporasyon yöntemi kullanılmıştır. PAA/EDC/NHS kaplı, TLZ yüklü MSN ve tetradekaflorohekzan içeren PLGA nanopartikül formülasyonlarına scFvEGFR konjugasyonu gerçekleştirilmiş ve sonuç formülasyon hazırlanmıştır. Sonuç formülasyonların küresel yapıda olduğu ve uzun süreli salım sağladığı tespit edilmiştir. Formülasyonların hücre kültüründe belirli düzeyde hücreler üzerinde sitotoksisiteye sahip olduğu gösterilmiştir. Formülasyonun hedeflendirme maddesi (scFvEGFR) taşımasının hücre kültüründe hücre içi alımını artırdığı gösterilmiştir. İn vivo çalışmalarda sonuç formülasyonun diğer formülasyonlara ve TLZ çözeltisine göre sıçanlarda GBM modeli tedavisinde etkili olduğu gösterilmiştir. Bu sonuç TUNEL yöntemi ile teyit edilmiştir. Tümör büyüklüklerinin değerlendirmesinde histopatolojik sonuçlar ve MR sonuçları arasında güçlü bir korelasyon bulunmuştur. Biyodağılım çalışmalarında TLZ çözeltisine göre sonuç formülasyonun beyin dokusuna daha yüksek oranda TLZ taşınmasını sağladığı gösterilmiştir.Literatürdeki güncel araştırmalarda tümördeki hipoksik bölgeler nedeniyle radyoterapide etkin sonuçlar alınamadığı ve güçlü bir radyo-duyarlılaştırıcı olması nedeniyle oksijen molekülünün bu problemin aşılmasında etkin rol alabileceği bildirilmiştir. Bu nedenle tez kapsamında geliştirlecek nanopartikül formülasyonunda yüksek oksijen taşıma kapasitesine sahip olan perflorokarbon kullanılacaktır. Ayrıca antikorlara göre daha az immünojenik ve küçük boyutta olmaları nedeniyle nanopartiküllerin hedeflendirilmesinde hastalığa spesifik hedefleme ligantlarından antikor fragmanları kullanılacaktır. Poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP) inhibitörleri, hücrelerde meydana gelen DNA hasarını onarılmasını sağlayan PARP'ı inhibe ederek etki göstermeleri ve kemoterapötik ilaçlara göre daha az yan etki oluşturmaları nedeniyle tümör tedavisinde oldukça dikkat çekmektedir. Bu nedenle tez kapsamında etkin madde olarak bir PARP inhibitörü kullanılması hedeflenmektedir. Bütün bu bilgilerin ışığı altında bu tezin amacı, glioblastomun tedavisini sağlamak üzere, hedeflendirilmiş, perflorokarbon ve etkin madde içeren PLGA nanopartikül formülasyonlarının tasarlanması ve hücre kültürü ve tümör geliştirilmiş deney hayvanları üzerindeki etkinliğinin değerlendirilmesidir.
Semi-otomatik doku analiz yöntemi ile grade- 4 glial tümörlerin postoperatif rezeksiyon kavite MRG bulgularının değerlendirilmesi
Grade-4 glial tümörlerin cerrahi sonrası rezeksiyon kavitesi takibinde, ileri görüntüleme yöntemlerinin klinik kullanımına rağmen kavite bulgularının ['progresyon', 'psödoprogresyon/radyasyon nekroz (KRT)'] ayrımında halen güçlük yaşanmaktadır. Bu güçlük nedenleri arasında deneyim ve yorum farkı öncelikli olmakla birlikte, takip görüntülemede ileri görüntüleme yöntemlerinin yüksek maliyet nedeniyle rutin kullanılamaması yer almaktadır. Çalışmada amacımız son yıllarda radyolojik görüntüleme teknikleri kullanılarak tekstür (texture) öznitelikleri ile elde edilen doku karakterlerinin farklılığından faydalanarak cerrahi kavite ve etrafında oluşan tedaviler ilişkili görüntüleme bulgularının ayırt edilebileceğini göstermektir. Bu ayrım perfüzyon MRG, MR-spektroskopi gibi ileri görüntüleme yöntemlerine gerek kalmaksızın konvansiyonel sekanslar, difüzyon ve manyetik duyarlılık görüntülemenin tekstür öznitelikleri kullanılarak yapılabilir. Çalışmaya grade-4 glial tümör tanısı (Glioblastom, IDH-wild tip ve astrositom, IDH-mutant) alan, kemoradyoterapi sonrası takip MRG'leri Temmuz 2018-2022 tarihleri arasında kliniğimizde yapılan ve 18 yaşından büyük erişkin hastalar dahil edildi. Beyin MRG'de karşılaşılan patolojik alanın segmentasyonu yarı otomatik yöntem ile 'OLEA SPHERE' programında iki farklı sekans (FLAIR ve postkontrast T1A (cT1) sekansları) referans alınarak 5 farklı sekans üzerine örtüştürerek yapıldı ve toplam 10 sekanstan öznitelikler çıkarıldı. Önemlilik düzeyi yüksek özniteliklerin belirlenmesi için Information Gain yöntemi kullanıldı. Cerrahi kavitede tedaviler ilişkili ortaya çıkan ve görüntülemeye yansıyan takipte 'stabil tümörsüz kavite', 'psödoprogresyon\radyasyon nekrozu (KRT)' ve 'progresyon' bulgularını birbirinden ayırmak için her sekanstan elde edilen önemlilik düzeyi yüksek öznitelikler ile hastaların klinik (yaş-cinsiyet) ve tümöre ait moleküler (IDH durumu) biyobelirteçler kombine edilerek ana veri modeli oluşturuldu. Hastaların cerrahi kavite bulgularının sınıflandırılmasında patolojisi olanların patoloji sonucundan faydalanıldı, olmayanların ise takip görüntülemeleri değerlendirilerek karar verildi. Ana veri modelini oluşturmak için 108 hasta, modelin validasyonu için ise 68 hastanın MRG tetkikleri analiz edildi. Her bir sekans [ADC, FLAIR, cT1A, MDG (SWAN/SWI), MAGIC T1A] için oluşturulan modellerin sınıflama performansını artırmak için hibrit yöntem kullanıldı. En yüksek doğru sınıflama oranı (DSO) %75 oranı ile tedavi ilişkili cerrahi kavite görüntüleme bulgularının birbirinden ayırt edilebileceği gösterildi. Cerrahi kavite bulgularını rKT1A sekansı referans alınarak oluşturan modeller daha yüksek performans gösterdi ve bu durum seçilen özniteliklerin kontrast tutan alanların doku karakterini daha iyi yansıtmış olabilmesine bağlandı. Anahtar Kelimeler: glioblastom, grade-4 astrositom, tekstür analiz, IDH-mutant, IDH-wild
Primer ve sekonder glioblastomaların metabolomik yaklaşımla incelenmesi
daha sonra doldurulacakGlioblastom erişkin çağda görülen en sık beyin tümörüdür. Tüm tedavilere rağmen ortalama sağ kalım 15 ay civarındadır. Glioblastom farklı genetik yollarla gelişen primer ve sekonder alt türleri içerir. Bu çalışmada morfolojik olarak aynı olan ancak genetik olarak son derece farklı olan primer ve sekonder glioblastomlu hastalardan elde edilen doku örneklerinde bu tümörlerin gelişime ışık tutabilecek metabolomikleri tespit ederek, kişiye özel tedavilerin planlanması ve tedaviye alınacak yanıtın rekürrens olmadan değerlendirilmesi amaçlandı. 6 adet normal, 37 adet primer gliomblastom, 10 sekonder glioblastom ve 5 adet düşük evreli tümör dokusu Q-TOF LC/MS ile incelendi. Glioblastomlarda lipid mediatör olan prostaglandinler (PG'ler), tromboksanlar (TX'lar), lökotrienler (LT'ler), lipoksinlerden (LX'ler) oluşan eikozanoidlerin artışı ile ilişkili metabolitler izlendi. Safra asitleri ve metabolitlerinin glioblastomlarda arttığı saptandı. C21 steroid sentez artışı, C21, C19 ve C18 steroid metabolizmasının yavaşlaması gösterildi. Sekonder glioblastomalarda daha fazla olmak üzere tüm glioblastomalarda alfa-Tokotrienolün arttığı saptandı. Glioblastomlarda sağ kalımı uzatabilmek için eikozanoid, steroid, kolesterol, safra asitleri ve sentez yolakları ile ilgili hedeflenmiş ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. tır
Glioblastoma hücre hatlarında uyarılmış pluripotent kök hücre (UPKH) kaynaklı eksozomların terapötik etkisinin analizi
En ölümcül kanser türleri arasında görülen glioblastoma, sağkalımı oldukça düşük olan bir primer beyin tümörüdür. İlaç direnci ve kan beyin bariyerini geçme zorluğundan dolayı mevcut tedavilerle bile glioblastoma vakalarında sağkalım oldukça düşüktür. Mevcut tedavilerin yanı sıra kan beyin bariyerini kolaylıkla geçebilen ve toksik etki oluşturmayan eksozomlar, GBM tedavisi için umut vaat eden biyolojik bir araçtır. Yapılan daha önceki çalışmalar, embriyonik kök hücre kaynaklı eksozomların glioblastomada antitümörijenik etkilere sahip olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, embriyonik kök hücreler gibi etik problemler teşkil etmeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerden kaynaklanan eksozomların aynı etkiye sahip olup olmadığı bilinmemektedir. Bu nedenle, yapılan bu tez çalışmasında, embriyonik kök hücrelere yakından benzeyen ve sınırsız çoğalma kapasitesine sahip olan uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı eksozomlar, bir glioblastoma hücre hattı olan LN18 hücrelerinde uygulanmış ve hücre canlılığıyla birlikte GBM-ilişkili bazı genlerin ifadesi analiz edilmiştir. Bunun yanı sıra sınırsız çoğalan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin kullanılmasıyla kaynağa bağlı düşük eksozom verimliliğinin önüne geçilmiştir. Elde edilen verilerle uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı eksozomların GBM hücre canlılığını azlattığı ve GBM-ilişkili genler üzerinde etki ettiği gözlenmiştir. Haliç Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü'nün bilimsel araştırma ve uygulama çalışmalarına verdiği destekle gerçekleştirilen bu tez çalışmasının sonuçları, anti-GBM etkisinin olduğu gözlenen uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı eksozomların, GBM için potansiyel bir terapötik araç olabileceğini göstermektedir.
Leptin ve leptin reseptör antagonistinin glioblastoma temozolomid direncindeki rolü
Glioblastoma (GB) bilinen en malin beyin tümörüdür. GB, radyoterapi ve kemoterapi uygulamalarına moleküler ve klinik özellikleri açısından sıklıkla dirençlidir. Kemoterapide kullanılan en yaygın ilaç Temozolomid (TMZ)'dir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda, leptinin kanser tedavisinde gelişen kemoterapötik dirençte rol oynayabileceği belirtilmektedir. Bu tez çalışmasında; Glioblastoma'da TMZ'ye karşı gelişen kemoterapötik dirençte, leptin ve/veya leptin antagonistinin (SHLA) olası rolünün araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada T98G, U373 MG ve LN-405 GB hücre serileri kullanılmıştır. Bu hücrelerde TMZ, leptin ve SHLA'nın sitotoksisitesi MTT ile saptanmıştır. TMZ, leptin ve SHLA'nın tekli kullanımlarının ve ikili, üçlü kombinasyonlarının TMZ direnç yolağında yer alan MGMT, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 genlerinin ekspresyonları üzerine etkisi RT-PZR ile saptanmıştır. Moleküllerin genomik DNA hasar etkisi COMET ve hücre döngüsüne olan etkileri ise akım sitometri ile belirlenmiştir. TMZ, leptin ve SHLA'nın TMZ direnç yolağındaki genlerin ekspresyonlarına olan etkileri birbirinden farklılık göstermektedir. Genomik DNA hasarı ve hücre döngüsü açısından hücre serileri arasında anlamlı farklılıklar saptanmıştır. Elde edilen veriler TMZ, leptin ve SHLA'nın hücre tipine göre kemoterapötik dirence farklı düzeyde katkı sağladığı, leptinin özellikle MGMT ekspresyonunu arttırdığı, MMR genlerinde ise genel olarak değişikliğe neden olmadığı tespit edilmiştir. Leptin ve SHLA'nın tek başlarına genomik DNA'da hasar oluşturabildiği ve hücrelerin G1 fazında birikmesine neden olduğu ancak kombinasyonlarda bu etkinin hücre tiplerine göre farklılık gösterdiği saptanmıştır. Sonuçlarımız, leptin ve SHLA'nın tek ve kombine kullanımlarının TMZ kemoterapötik direncinde rol alabileceğini ve bu etkinin hücre tipine göre ve gen spesifik olarak değiştiğini göstermektedir. Bu tez çalışması, leptin ve SHLA'nın TMZ direncindeki etkisinin araştırıldığı ilk çalışmadır.
İn vitro ortamda insülin reseptör substrat 1 (IRS1) bağımlı sinyal iletim ağının glioblastoma multiforme gelişimindeki rolünün belirlenmesi
Beynin temel enerji kaynağı glukozdur ve beyin, glukozu yoğun bir şekilde kullanmaktadır. Dolayısıyla beynin fizyolojik rolünü yerine getirmesi, glukoz metabolizmasının sıkı bir şekilde kontrolü ile sağlanmaktadır. İnsülin Reseptör Substrat (IRS) proteinleri, glukoz metabolizmasının regülasyonunda rol alan en önemli adaptör proteinlerdir. IRS1 bu protein ailesinin üzerinde en çok çalışılan elemanıdır. IRS1, kanserle ilgili birçok reseptörle etkileşime geçmektedir ve literatürde IRS1'in meme, akciğer, prostat, böbrek gibi birçok kanser türünde ekspresyon artışı gösterilmiştir. Yapılan çalışmalarda merkezi sinir sistemi tümörlerinden biri olan medulloblastomda da IRS1 ekspresyonunun arttığı gösterilmiştir. Bizde bu bilgiler ışığında, IRS1'in merkezi sinir sisteminin bir diğer önemli tümörü olan glioblastoma multiforme (GBM) gelişiminde de böyle bir ekspresyon artışı olabileceğini düşündük. Buradan yola çıkarak in vitro ortamda IRS1 bağımlı sinyal iletim ağının GBM gelişimindeki rölünü belirlemeyi amaçladık. Çalışmada, U-87 MG hücre hattı kullanıldı. IRS1 proteinin ekspresyonunu U-87 MG hücrelerinde arttırmak amacıyla pcDNA3.1-flag tagged-insan IRS1 ekspresyon vektörü lipofektamin aracılığı ile hücrelere transfekte edildi. Ektopik IRS1 ekspresyon artışının GBM hücrelerinin sağkalımı üzerindeki fonksiyonel etkisi MTT analizi, insülin sinyali üzerindeki moleküler etkisi western blot analizi ile belirlendi. Elde ettiğimiz sonuçlar, ektopik IRS1 ekspresyon artışının GBM hücre sağkalımını arttırdığını göstermektedir. Ayrıca, IRS1 ekspresyon artışının, insülin indüklü Grb2, ERK ve AKT proteinlerinin aktivasyonlarında artış gerçekleştirdiği saptanmıştır. Çalışmamız, GBM hücrelerinde IRS1 ekspresyon ve aktivasyon artışının, hücre sağkalımını AKT aktivasyonu aracılığıyla arttırdığını ortaya koymaktadır. Anahtar Kelimeler: Beyin Tümörleri, Glioblastoma Multiforme, IRS1, İnsülin Reseptör Substrat Proteinleri (IRS), İnsülin Sinyali.
Glioblastoma multiforme, menenjiyom (birincil) ve metastaz (ikincil) beyin tümörlerine ait fenotiplerin belirlenmesinde kullanılacak bütünleşik omiks analizler için analitik yöntem geliştirilmesi ve uygulanması
Genotip ve fenotip arasındaki doğrudan nedensel ve fonksiyonel bağlantıları göstermek için protein, metabolit ve lipit gibi ara moleküler seviyelerin kapsamlı şeklilde incelenmesi çok önemlidir. Kapsamlı metabolomik ve lipidomik analizler için birden çok analitik tekniğe ve analiz koşullarının optimizasyonuna ihtiyaç vardır. Çalışma kapsamında metabolomik analizler eş zamanlı olarak GC-MS ve LC-qTOF-MS ile lipidomik analizler ise LC-qTOF-MS ile gerçekleştirilmiş ve kullanılan analitik yöntemler çeşitli deneysel tasarımlar ile optimize edilmiştir. Plazma örnekleri için metanol:su:kloroform (3:1:3, h/h/h), doku örnekleri için ise metanol:su:diklorometan (2:1:3, h/h/h) metabolitlerin, lipitlerin ve hatta proteinlerin tüketilmesi için optimum çözücü karışımları olarak belirlenmiştir. Doku örneklerinin GC-MS temelli metabolomik analizleri için sililleme reaktifinin inkübasyon süresi ve sıcaklığının, metoksiamin derişimi-metanol hacmi etkileşiminin, plazma örnekleri içinse metoksiamin derişimi ile sililleme reaktifinin inkübasyon süresinin ve metanol-metoksiamin hacmi etkileşiminin analiz sonuçlarını etkileyen önemli parametreler olduğu belirlenmiştir. LC-qTOF-MS temelli metabolomik analizler için uçurulan örneklerin yeniden çözülmesinde kullanılan hareketli faz bileşiminin hem doku hem de plazma örneklerinden yapılan analizlerin sonuçlarını etkilediği tespit edilmiştir. LC-qTOF-MS temelli metabolomik ve lipidomik analizlerin kromatografik koşullarına etki eden parametreler ise Box-Behnken tasarımı ile optimize edilmiştir. Metabolomik ve lipidomik analizler için geliştirilen analitik yöntemler beyin tümörlü hasta grupları ile kontrol grubunu oluşturan bireylerden toplanan doku ve plazma örneklerine uygulanmış ve bu tümörlere ait fenotipler aydınlatılarak sonuçlar klink açıdan bütüncül olarak değerlendirilmiştir.
Glioblastomanın görüntüleme ve fotodinamik tedavisi için multifonksiyonel, hedeflendirilmiş, teranostik lipozomların geliştirilmesi ve etkinliğinin ın vitro incelenmesi
Beyin tümörlerinin en yüksek insidans ve en düşük sağkalıma sahip türlerinden olan glioblastomanın (GBM) etkili teşhis ve tedavisinde halen istenilen başarı sağlanamamış ve etkili ve spesifik teşhis ve tedavi ajanları üzerine çalışmalar artmıştır. Tez çalışmasında GBM teşhis ve tedavisi için GLUT1'e hedeflemek amacıyla N-asetil glukozamin (NAG) ile modifiye edilmiş; PET/BT görüntüleme için 68Ga ile işaretlenmiş, fotodinamik/fototermal tedavi (PDT/PTT) ve NIR görüntüleme amacıyla IR780 hapsedilmiş, PEG kaplı, nanoboyutlu nötral ve pozitif yüklü teranostik lipozomlar geliştirilmiş, karakterizasyon, in vitro salım profilleri ile stabilite çalışmaları ve işaretleme verimi, işaretlemenin stabilitesi çalışmaları yapılmıştır. Hücre tutulumları RG2 ve U87, NIR ve floresans mikroskop görüntüleri RG2 hücre hattında alınmış ve PDT/PTT etkinlikleri NIR ışığında (808 nm, 0.8-1 W/cm²) değerlendirilmiştir. Sitotoksisiteleri RG2, U87 ve L929 hücre hatlarında incelenmiştir. Optimum ortalama partikül boyutuna (181-193 nm), enkapsülasyon etkinliğine (%79-84) ve zeta potansiyele (-5 - -7 mV) sahip lipozomlar Langenbucher kinetiğine uygun salım göstermiştir. pH:3,5, 80oC'de ve 5 dk. inkübasyon süresinde 68Ga ile maksimum işaretleme verimi saptanmıştır. 4oC'de 30 gün stabil kaldıkları ve hedeflendirilmiş formülasyonların hedeflendirilmemişlere, pozitif yüklülerin ise nötral formülasyonlara göre hücre içine alımının daha fazla olduğu saptanmıştır. Formülasyonlar NIR ışığı (808 nm, 0.8-1 W/cm²) altında PDT/PTT etkinliği göstermiş ve L929 hücre hattında RG2 ve U87'ye göre daha düşük sitotoksisite göstermiştir. Hedeflendirilmiş lipozomlar GBM'nın in vitro olarak PDT/PTT ile tedavi ve PET/BT ve NIR görüntülemede etkili potansiyel teranostik ajanlar olarak değerlendirilmiştir.
Polidopamin bazlı teranöstik taşıyıcıların geliştirilmesi
Bu çalışmada değişen boyut aralıklarında polidopamin (PDA) ve PDA-Ce6 nanopartiküllerinin (NP) sentezi yapılmıştır. Sentezi yapılan nanopartiküllerin taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile görüntüleri alınarak karakterizasyonları yapılmıştır. Sentez ortamına 2-propanol (IPA) eklenmesinin reaksiyonu inhibe ederek partikül boyutunu küçülttüğü, dopamin hidroklorür miktarının arttırılmasının ise partikül boyutunu büyüttüğü görülmüştür. 200 nm ve 500 nm boyut dağılımına sahip PDA NP'lerin ve PDA-Ce6 NP'lerin fototermal terapi (FTT) potansiyelleri incelenmiştir. Sonuçlar, 200 nm PDA, 500 nm PDA ve PDA-Ce6 NP'lerin FTT'de kullanılabilir ajanlar olduğunu göstermektedir. PDA-Ce6 NP'lerin fotodinamik terapi (FDT) potansiyeli incelenmiş ve reaktif oksijen radikalleri (ROS) üretiminin FDT'de kullanılabilecek düzeyde olduğu görülmüştür. İn-vitro hücre deneyleri L929 ve T98G hücre hatları ile yapılmıştır. Yapılan sitotoksisite deneylerinde hem 200 nm PDA NP'lerin hem de PDA-Ce6 NP' lerin düşük sitotoksisiteye sahip oldukları görülmüştür. 200 nm PDA NP'lerin FTT deneyleri, PDA-Ce6 NP'lerin ise FTT, FDT ve kombine FTT-FDT deneyleri yapılmıştır. 200 nm PDA NP' lerin FTT uygulaması sonucu 100 μg/ml NP derişiminde ortamdaki hücrelerin %45'ini öldürdüğü görülmüştür. PDA-Ce6 NP' lerin ise 100 μg/ml NP derişiminde ortamdaki hücrelerin FTT uygulamasında %53, FDT uygulamasında %49 ve kombine FTT-FDT uygulamasında %58 öldürdüğü görülmüştür.
Hedeflendirilmiş ilaç yüklü nanopartiküllerin glioblastoma üzerine olan etkilerinin incelenmesi
Oldukça agresif bir primer beyin kanseri olan glioblastomanın güncel tedavisi radyoterapi ve temozolomid (TMZ) ile yapılmaktadır. Ancak TMZ'ye direnç gelişmesi, kanserin tekrarlaması ve mortalite oranının yüksek olmasından dolayı yeni tedavilere ihtiyaç vardır. Bu kapsamda nanopartiküller (NP'ler) yeni tedavi seçenekleri sunabilir. Bu çalışmada TMZ yüklü insan serum albumin (HSA) NP'leri (TMZ&NP) sentezlendi. Glioblastomaya hedeflendirilmek için NP'ler, folik asit (FA), transferin (Tf) ya da aterosklerotik plak (AP) ligandları ile konjuge edildi. NP'lerin etkinliği in vitro ve in vivo olarak glioblastomada araştırıldı. TMZ&NP'ler liganda bağlı olarak C6 glioma hücrelerinde yüksek sitotoksisiteye sebep oldu. TMZ, TMZ&NP ve TMZ&NP-FA C6 sfereoid çaplarının büyümesini engelledi. TMZ, TMZ&NP ve TMZ&NP-AP sfereoidlerde aktif kaspaz-3+ hücrelerini arttırdı. Ortotopik sıçan glioblastoma modelinde TMZ&NP formülasyonlarının Glioma gruplarında vücut artış hızına olumlu etkisi görüldü. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) analizlerine göre TMZ, TMZ&NP, TMZ&NP-FA, TMZ&NP-Tf ve kombine tedavileri tümör boyutunu azalttı. Relatif serebral kan akımı (rCBF); TMZ&NP, TMZ&NP-Tf ve TMZ&NP-AP uygulamaları ile azaldı. Tümördeki hücresel hasar TMZ&NP-FA, TMZ&NP-AP ve kombine NP tedavileri ile arttı. Peritümöral alandaki damar sayısı TMZ&NP-FA ve TMZ&NP-Tf uygulamaları ile azaldı. TMZ&NP, TMZ&NP-FA ve TMZ&NP-Tf tümörün merkezindeki VEGF+ hücreleri azalttı. Ultrastrüktürel analizler NP'lerin neokorteks, hipokampüs, korpus kallozum ve tümör dokularında nöronlar, glia hücreleri, aksonlar, tümör hücreleri ve kan beyin bariyeri (KBB) ile ilişkili yapılara internalize olduklarını kanıtladı. Sonuç olarak bu çalışma aktif hedefleme sistemlerinin önemini vurgulamakta ve NP formülasyonlarının glioblastoma tedavisinde işlevsel bir araç olabileceğini göstermektedir. Bu sistemler insan glioblastoma modellerinde araştırılarak güvenirlikleri ve etkinlikleri ileri düzeyde araştırılmalıdır.
Karmustin yüklü katı lipid nanopartiküllerin hazırlanması, karakterizasyonu ve beyin kanseri hücre hattında in vitro etkinliğinin araştırılması
Dünya çapında meydana gelen ölümlerin ikincil sebebi olan kanser, hücrelerin bölünme yeteneklerinin farklılaşması ve çevre dokulara yayılma gibi özellikler ile karakterize edilen bir hastalıktır. Glioblastoma, merkezi sinir sistemi onkolojik hastalıkları arasında bulunmakta ve primer beyin tümörlerinin % 30' unu oluşturmaktadır. Yaygın olarak yetişkenlerde görülen, invaziv ve agresif özellikte bir beyin tümörüdür. Cerrahi müdahale, radyasyon ve kemoterapi tedavi seçenekleri arasındadır, ayrıca son yıllarda immunoterapi ile tedavi potansiyeli araştırılmaktadır. Kullanılan tedavi yöntemlerinin yan etkileri ve tedavi sonrası sağ kalım oranlarının düşük olması sebebiyle ilaç taşıyıcı sistemler gibi yeni tedavi seçeneklerinin kullanımına ihtiyaç duyulmuştur. Bu çalışmada glioblastoma tedavisinde kullanılan anti-kanser ajanı olan karmustini içeren katı lipid nanopartiküllerin sentezi ve karakterizasyonu yapılmış, oluşturulan sistemin in vitro etkinliği araştırılmıştır. Nanopartiküllerin kan-beyin bariyerinden geçişi için beyin endotel hücrelerinde bulunan MCT-1 reseptörüyle etkileşmeyi sağlayacak stearilamin/β-Hidroksi bütirat konjugatı sentezlenmiştir. Ayrıca nanoyapının sentezi sırasında kan-beyin bariyerini aşmada yardımcı olduğu bilinen Tween 80 ile katı lipid nanopartiküllerin yüzeyleri kaplanmıştır. Karmustin içeren katı lipid nanopartiküller için optimum ilaç miktarı 0,1 mg/ml olarak belirlenmiştir. Nanoyapıların boyutu zeta boyut ölçüm cihazı ve SEM analizi ile belirlenmiş ve zeta potansiyel analizi yapılmıştır. Karakterizasyonu yapılan katı lipid nanopartiküllerin U87-MG-luc hücreleri üzerindeki sitotoksisite denemeleri sonucunda 48. ve 72. saat IC50 değeri sırasıyla 353,4 and 442,3 µg/ml olarak tespit edilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda karmustin içeren katı lipid nanopartiküllerin beyin kanseri hücre hattı üzerinde etkili sitotoksik potansiyele sahip olduğu düşünülmektedir.
Temozolomid içeren katı lipid nanopartikül hazırlanması, karakterizasyonu ve beyin kanseri hücre hattında etkinliğinin araştırılması
Merkezi sinir sisteminde beyin tümörleri arasında glioblastoma en sık karşılaşılan ve ölümcül olan kanser türüdür. Malignant glioblastomanın heterojen yapısı ve agresif özelliğine sahip olması hastalarda ortalama sağkalımı yaklaşık 15 ay gibi kısa bir süre belirlenmiştir. Bunun yanında hastalığın teşhisin zor olması, kemoterapötik ajanların kan beyin bariyerinden geçişi, ilaç dirençliliği gibi faktörler tedaviyi oldukça kısıtlamaktadır. Glioblastomada kullanılan tedavi yöntemlerinden cerrahi müdahale, radyasyon ve kemoterapi uzun süreli sağkalım oranın arttırılmasında etkili olmamıştır. Tüm bu sorunlara alternatif çözüm bulmak için araştırmacılar farklı tedavi yaklaşımlarını incelemektedir. Nanoteknoloji alanındaki gelişmelerin glioblastoma tedavisinde karşılaşılan zorluklara çözüm olabileceği öngörülmüştür. İlaç taşıyıcı sistemlerden lipid bazlı nanotaşıyıcıların sahip olduğu kan-beyin bariyerinden geçişi kolaylaştırma, hidrofobik ilaç çözünürlüğünü arttırma, yüzey modifikasyonuna olanak tedavi için önemli avantajlar sağlar. Bu çalışmada glioblastoma multiform tedavisinde temozolomid içeren katı lipid nanopartiküllerin sentezlenmesi, karakterizasyonu ve in-vitro etkinliğini araştırılmıştır. Sentezlenen nanoyapının kan-beyin bariyerinden geçişini sağlayabilmek için stearil amin ile konjugasyonu yapılması ve sentez aşamasında Tween 80 ile katı lipid nanopartiküllerin yüzeyi kaplanması amaçlanmıştır. Temozolomid içeren katı lipid nanopartiküller için optimum ilaç miktarı 0,1 mg/ml olarak belirlenmiştir. Nanoyapıların boyut analizi zeta boyut ölçümü ve SEM analizi ile belirlenmiş, ayrıca zeta potansiyel analizi yapılmıştır. Katı lipid nanopartiküllerin U87-MG-luc hücreleri üzerindeki sitotoksisite denemelerine göre 48. ve 72. saat IC50 değeri sırasıyla 430,8 ve 438,8 µg/mL olarak tespit edilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda temozolomid içeren katı lipid nanopartiküllerin beyin kanseri hücre hattı üzerinde etkili sitotoksik potansiyele sahip olduğu düşünülmektedir.
Glioblastoma multiforme ve glioblastoma multiforme kanser kök hücreleri ile astrosit ko-kültürlerinde, siklopamin inhibisyonu ile sonıc hedgehog sinyal yolağı ve ilişkili mekanizmalarda karşılıklı bağlantıların moleküler yöntemlerle araştırılması
Kanser, bir grup hücrenin kontrolsüz bölünme, invazyon ve metastaz gibi özellikler sergileyerek oluşturduğu bir hastalıktır. Embriyogenez sırasında da kontrollü hücre bölünmesi, hücre farklılaşması, hücre göçü ve programlanmış hücre ölümü görülür. Embriyo gelişimi ve tümör oluşumu, hücre göçü, invazyon, hücre farklılaşması ve immün cevaptan kaçabilme gibi benzer hücre davranışları sergileyebildikleri gibi bu iki tip hücrenin gen ekspresyonu, protein profilleri, sinyal yolakları da benzerdir. Hedgehog gen ailesi üyelerinden Sonic Hedgehog (Shh) sinyal yolağı, hem embriyogenez hem de karsinogenezde aktif olabilen önemli sinyal yolaklarından biridir. Bu yolaktaki aktivasyon artışları ile medulloblastoma, rabdomyosarkoma, kolorektal karsinoma gibi birçok kanser tipi ortaya çıkabilir. Glioblastoma multiforme (GBM), erişkin insanlarda en sık görülen primer kötü huylu beyin tümörü olup uzak organ yayılımı olmasa da oldukça hızlı büyüyen infiltratif bir tümördür. Tümörler heterojen hücrelerden oluşmakta olup; tümör kitlesi içinde kök hücreler gibi kendini yenileme ve farklılaşma özellikleri bulunan, radyoterapi, kemoterapiye dirençli olan, uzak organ yayılımları yapabilen ve kanser rekürrensinde etkisi olduğu düşünülen kanser kök hücreleri (KaKH) de bulunmaktadır. GBM'li olguların tümör kitleleri içinde de kanser kök hücreleri tanımlanmıştır ve bu hücreler prognozun kötüleşmesine neden olabilirler. Son yıllarda GBM tedavisi için Hedgehog sinyal yolağı önemli bir hedef haline gelmeye başlamıştır. Siklopamin, Smoothened (Smo) reseptörüne bağlanarak Shh sinyal yolağının inhibe edilmesinde kullanılan ve hayvan deneyi çalışmalarında gliomalar, pankreatik ve kolon karsinomlarında tümör büyümesini de inhibe ettiği gösterilen önemli bir ajandır. GBM ile ilgili çeşitli ko-kültür ve mikro-çevre araştırmaları ise henüz yeterli değildir. Literatür bilgilerine dayanarak, Sonic Hedgehog sinyal yolağının embriyonik dönemde önemli bir rol oynadığı bilinmekte, kanser ve kanser kök hücrelerinde de aktif olduğu ve tedavi direncinde de etkili olabileceği düşünülmektedir. Literatür bilgileri ışığında, çalışmamız ile GBM ve GBM kanser kök hücrelerinin astrositler ile ko-kültüre edilmesi ve bu ortamda Shh sinyal yolağının etkisi ve bu yolağın inhibe edilerek sonuçların değerlendirilmesi planlanmıştır. Ko-kültür ortamında hücre-hücre etkileşimleri değerlendirilip GBM ve GBM kanser kök hücrelerinde aktive olan Shh sinyal yolağını astrosit varlığında siklopaminin inhibisyon etkisinde bir değişim olup olmadığı aynı zamanda hücrelerin parakrin olarah Shh protein salgılayabilme özellikleri araştırılarak hücre-hücre etkileşimlerinin de Shh sinyal yolağının siklopamin ile inhibisyonu üzerine olumlu ya da olumsuz etkisi olup olmadığı sorusuna cevap aranmıştır. Sonuç olarak GBM ve GBM kanser kök hücrelerinde Shh sinyal yolağı inhibe edildiğinde beraberinde etkilenebilecek apoptoz ve hücre siklusu gibi hücre içi mekanizmalarındaki değişimler PCR, immünofloresan, ELISA, TUNEL, hücre siklusu analizi gibi yöntemlerle araştırılmıştır. Siklopamin, Shh yolağını baskılamada etkili bir ajandır; tek başına yeterli derecede hücre ölümüne neden olamasa da; GBM ve GBM KaKH'lerinde Shh yolağı aktivasyonunun görülmesi, kombine kanser terapilerinde Shh yolağının baskılanması gerekliliği ortaya koymuştur. GBM ve GBM KaKH kontrol gruplarının sonuçları ve siklopaminden etkilenmeleri RNA ve protein düzeyinde birbirlerinden farklıdır. Bu hücreler ile ko-kültür uygulandığında çoğu zaman farklı sonuçlar elde edilmiştir. Yapılan çalışma sonucunda özellikle tekli hücre kültürü ve ko-kültür sonuçlarının farklılığı ele alındığında, hastalıklarda ve tedavilerinde mikro-çevre etkisinin önemi ortaya koyulmuştur.
Glioblastom kök hücrelerini görüntüleme amaçlı gepı temelli hetero-fonksiyonel peptidler
Altın nanopartiküllerin (ANP) nano-tıp alanında yüksek bir potansiyele sahip olduğu gösterilmektedir. Yüksek elektron yoğunluğu ve benzersiz optik özellikleri nedeniyle, ANP'ler biyo-görüntülemede kontrast maddesi, tanı probları ve hedefleyici sistemler olarak verimli bir biçimde kullanılabilmektedir. ANP'ler ayrıca hipertermi tedavisinde termal enerji taşıyıcısı olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, biyolojik sistemlerde taşınmaları için stabil ve sağlam yapıda olmaları ANP'lerin biyolojik işlevini kritik bir hale getirmektedir. Biyolojik işlev, nispeten sert koşullar ve kuvvetli indirgeyici ajanları içeren fiziksel veya çok basamaklı kimyasal yöntemlerle biyolojik bir yapının ANP'lerle birleştirilmesiyle kazandırılır. Bu çalışmada, tasarlanmış peptid temelli kendiliğinden birliktelik fonksiyonilizasyon metodu glioblastom (GBM) kanser kök hücreleri (KKH'leri) ni özgün hedefleyen fonksiyonilize ANP'lerin oluşturulması için kullanıldı. Tasarlanan peptid dizileri hem gliom hücresine bağlanan peptid hem de ANP yüzeyi ile kendiliğinden bir araya gelen altın bağlanma dizisini içermektedir. Altına bağlanan peptid dizisi, daha önce kombinatoryal FliTrx peptid kütüphane tekniği kullanılarak seçildi. Peptidlerin, 15nm çapında ANP'lerle bağlanma etkinliği lokalize yüzey plazmon rezonans spektroskopisi (LSPR) ile test edildi. Spektral tarama verisi GraphPad Prism 6.0 yazılımıyla değerlendirildi. AlamarBlue testi, fonksiyonel ANP'lerin NIH/3T3, U-87 MG ve GBM KKH hatları üzerindeki olası sitotoksik etkisinin tanımlanmasında kullanıldı. Hücre hatlarına göre, hetero-fonksiyonel peptidlerin bağlanma karakterini test etmek için hücre yayılım testi kullanıldı. Sonuçlar, kimerik peptid ile fonksiyonilize edilmiş ANP'lerin hücreye özgün hedefleme için geliştirildiğini gösterdi. Hetero-fonksiyonel peptidlerin bağlanma için hücre seçiciliğine sahip olduğu bulundu. Geliştirdiğimiz hetero-fonksiyonel peptid stratejisi yalnızca hücre görüntüleme için değil ayrıca potansiyel olarak kemoterapi ajanlarının yan etkisini düşürebilen tümör bölgesine özgün ilaç taşınımı ve nanopartikül ilişkili hipertermi tedavisinin geliştirilmesinde GBM hastaları için umut verici bir yaklaşım olarak kullanılabilir.
C6 glioma hücrelerinde morinda citrifolia ve paklitakselin etkilerinin araştırılması
Bu çalışmada in vitro C6 glioma hücre modelinde Morinda citrifolia (noni) ekstresi ve paklitakselin farklı konsantrasyonlarının ß-katenin sinyal yolu ile hücre proliferasyonunda meydana getirdiği değişiklikler immünositokimyasal olarak incelendi.Hücre proliferasyonunun değerlendirilmesinde hücre siklusunda S fazına özgü bir işaretleyici olan bromodeoksiuridin (BrdU) uygulandı. Noni ile inkübasyon sonrasında BrdU inkorporasyonunda kontrol gruba kıyasla azalma izlenirken, sadece paklitaksel uygulanan ve noniyle paklitakselin birlikte uygulandığı gruplarda S fazında hiç hücre gözlenmedi. Glioma hücrelerinde, plazma membranlarının intraselüler sınırları boyunca ß-katenin ekspresyonu izlendi. Noni ekstresi ile inkübasyon sonrasında plazma membranı seviyesinde normal seviyelerde ekspresyon izlendi. Paklitaksel inkübasyonu sonrasında nükleusta belirgin ß-katenin ekspresyonu izlendi. Noni ve paklitakselin birlikte uygulandığı gruplarda ise ß-katenin ekspresyon ve lokalizasyonunda bir değişiklik olmadığı görüldü.Çalışmamız sonucunda plazma membranında bulunan ß-katenin ekspresyonunun noni ekstresi uygulamasıyla değişmediği, düşük dozda paklitaksel uygulamasında nükleustaki ß-katenin ekspresyonunun arttığı izlendi.
Glioblastoma multiform (GBM) kanser kök hücrelerinde Mdivi-1 aracılı DRP-1 inhibisyonunun mitokondriyal fisyon ve mitofajiye etkisi
GBM'de, glioblastoma kök hücrelerinin (GKH) varlığının ilaç direncine ve tümörün nüksetmesine sebep olduğu bildirilmektedir. Yapılan çalışmalar, farklı moleküler, genetik ve metabolik özellikleri bakımından GKH'lerin nöral kök hücrelerden (NKH) ve farklılaşmış GBM hücrelerinden farklı olduklarını göstermektedir. Dolayısıyla, GKH'leri hedef alan yeni terapötik stratejilerin geliştirilebilmesi için GKH'lerin kök hücre özelliklerinin devamlılığını sağlayan mekanizmaların tam olarak anlaşılması önem arz etmektedir. Spesifik olarak GKH belirteçlerinden CD133 ve CD24 lentiviral olarak ayrı ayrı yüksek ifade eden GKH'lerde ilk kez fisyonda rol oynayan Drp1'in Mdivi-1 aracılı farmakolojik inhibisyonunun fisyon ve mitofaji mekanizmaları üzerine olan etkilerinin araştırılması sonucu hipotezimizi destekleyecek önemli ve özgün sonuçlar elde edilmiştir. GBM tedavisinde alternatif bir tedavi protokolü olarak mitokondriyal fisyon inhibitörünün tekli veya TMZ ile kombine kullanılmasının etkinliğinin GKH düzeyinde in vitro olarak ilk kez araştırılmıştır. Bu tez kapsamında apoptoz ve mitofaji ilişkili genlerin mRNA düzeyinde ifadesine bakılmıştır Eş zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile Fisyon için DRP-1, Fis1, Apoptozis için Bax, Bcl-2, Mcl-1, ve mitofaji belirteci olarak Pink1, Parkin genlerinin mRNA ifade analizleri yapılmıştır. Post-translasyonel düzeyde kontrol edilen Drp1'in aktive edici fosforilasyon ve inhibe edici fosforilasyon düzeyleri ise western blot analizi ile protein düzeyinde araştırılmıştır. Mdivi-1 uygulanan bulk tümör hücreleri ile iki farklı GKH hücre serilerinin bu inhibisyondan doza ve zamana göre etkilendiği ve TMZ'den daha etkili bir şekilde canlılıklarında azalmaya neden olduğu ilk kez belirlenmiştir. Hücrelerde gözlenen bu ölümün apoptozis aracılı gerçekleştiği belirlenmiştir. Mdivi-1 inhibitörünün Glioblastoma'da TMZ'den bağımsız apoptozisi uyaran ve kanser kök hücrelerini de hedefleyebilen alternatif terapötik ajan olarak kullanılabileceği ilk kez gösterilmiştir. Drp1 ifadesinin ve fisyon mekanizmasının CD24high hücrelerinde daha aktif olduğu ilk kez belirlenmiş ve Mdivi-1'in bu hücrelerde en etkili fisyon baskılanmasına neden olduğu gösterilmiştir. Mdivi-1'in tek başına veya TMZ'in birlikte düşük dozlarda uygulanmasının bulk tümör hücreleri ve GKH'lerde hücre canlılığına ve apoptozis üzerine olan etkilerinin ilk kez bu tez çalışmasıyla belirlenmiş olması, GBM tedavisinde kullanılabilecek alternatif yaklaşımların üretilmesine katkıda bulunacaktır. Anahtar kelimeler: Glioblastoma Kök Hücre, CD133, CD24, Mitokondriyal Kalite Kontrol, Mitokondriyal Metabolizma
Makrofaj türevli eksozomların glioblastoma hücresel davranışları üzerine etkilerinin moleküler düzeyde incelenmesi
Bu çalışmada, M0, M1 ve M2 polarize makrofaj türevli eksozomlar glioblastoma hücrelerinde moleküler düzeyde yarattığı farklılıkların araştırılması amaçlanmıştır. Eksozomlar, polarize makrofaj hücrelerinden izole edilmiş ve nano-yapıları TEM ile, protein miktarı kantitatif olarak BCA testi ile belirlenmiştir. M0, M1 ve M2 makrofajlarının U87 glioblastoma hücreleri ile kültürlenmesi ve eksozomların dolaylı etkisini araştırmak için eş-kültür sistemleri kurulmuştur. Eksozomların glioblastoma hücreleri üzerindeki doğrudan etkisi, U87 hücrelerine eksozomların direkt uygulanması yolu ile doğrulanmıştır. Eş-kültür deneylerinde hipotezin ispatı amacıyla bir optimizasyon süreci gerçekleştirilmiştir. Eksozomal sistem kurulurken iki farklı eksozom konsantrasyonu (10 ve 100 g/mL) denenmiş ve daha yüksek konsantrasyonun (100 g/mL) etkisinin daha fazla olduğu belirlenmiştir. Makrofaj fenotipinin glioblastoma hücrelerinin saldırganlığını ve kanser ilerlemesini etkilediği yapılan analizlerle doğrulanmıştır. Makrofaj eksozomlarının yüksek konsantrasyonda U87 hücreleri üzerinde canlılık ve çoğalma açısından olumsuz etkilerinin olmadığı canlı/ölü testi ve XTT testi ile doğrulanmıştır. Eksozom aracılı kanser hücresi davranışları, immünofloresan boyama ve gen ekspresyon çalışmaları gerçekleştirilerek kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bağışıklık sistemi üyesi makrofajların eksozomlarının in vitro yara iyileşme potansiyeli (scratch assay) ve anti-kanser ilaç direnci üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Elde edilen bulgulara göre, M0 makrofaj eksozomlarının immün yanıtlarda dualiteye sahip olduğu tespit edilirken, M1 makrofaj eksozomlarının glioblastoma hücrelerinin metastazını baskıladığı ve M2 makrofaj eksozomlarının glioblastoma hücrelerinin ilerlemesine katkıda bulunduğu anlaşılmıştır. Sonuç olarak, makrofaj eksozomların immünomodülatör özellikleri sayesinde terapötik hedefler için yeni stratejiler sunacağı düşünülmektedir.
Özefagus ca., serviks ca.ve glioblastome multiforme (GBM) tanılı hastaların tedavisinde kullanılan volümetrik ayarlı arc terapi (VMAT), yoğunluk ayarlı radyoterapi (IRMT) ve 3 boyutlu konformal radyoterapi (3BKRT) tedavi tekniklerinin karşılaştırılmalı değerlendirilmesi
Bu tez çalışmasında özefagus kanseri tanısı konan 20 hastanın; pelvis kanseri tanısı konan 20 hastanın ve beyin yerleşimli tümörü olan Glioblastome Multiforme (GBM) 20 hastanın VMAT, IMRT ve üç boyutlu konformal radyoterapi (3BKRT) teknikleri ile planları yapılarak; elde edilen sonuçların kritik organlar açısından farklı tedavi tekniklerinin karşılaştırılması amaçlanmıştır. Hedef hacim için tanımlanan dozun %100'ü hedef hacmin %95'ini alacak şekilde planlamalar yapılmıştır. Her bir teknik için bilgisayarlı tomografi (BT) kesitleri incelenerek hedef hacimde soğuk veya sıcak alanlar oluşmamasına özen gösterilmiş ve elde edilen doz-volüm histogramları (DVH) değerlendirilmiştir. Böylece kritik organların aldığı dozlar karşılaştırılmıştır. Özefagus Ca hastalarında yakın kritik organlardan akciğer, kalp, spinal korda bakılmış ve IMRT tekniğinin düşük doz bölgelerinde üstünlüğü diğer kritik organ değerlendirilmesinde VMAT tekniğinin üstün oluğu görülmüştür. Serviks Ca tanılı hastalarda rektum, mesane ve bağırsak dozlarına bakılmış ve burada VMAT tekniğinin anlamlı fark yarattığı görülmüştür. GBM hastalarında ise beyin sapı, optik kiazma, sağ optik sinir ve sol optik sinire bakılmıştır. Burada ise aynı şekilde VMAT tekniğinin avantajlı olduğu görülmekle birlikte IMRT tekniği de 3BKRT tekniğine göre avantajlıdır. Çalışmanın sonucunda tekniklerin birbirine ve farklı bölgelere göre avantaj ve dezavantajları görülmüştür.
Glioblastoma primer beyin tümörlerinde SIRT4'ün glutamat metabolizması ile ilişkisinin incelenmesi ve potansiyel tümör baskılayıcı özelliğinin araştırılması
Amaç: Eksitotoksisite; glutamatın, fazla salınım veya bozulmuş geri alım nedeniyle nöronlar arası boşlukta birikme durumudur. Eksitotoksisite birçok beyin hastalığında rol oynar. Nöronlar arası boşluğa salınan glutamatı, astrositlerde bulunan GLT-1 (Glutamat Transporter 1) toplar. Glutamatın bir kısmı, astrositlerde glutamat dehidrogenaz (GDH) tarafından α-ketoglutarata çevrilir ve TCA siklusuna girer. İkinci bir yol olarak; glutamat, astrositlerde glutamin sentetaz (GS) tarafından glutamine çevrilir. Glutamin, tekrar glutamaterjik nörona geçerek bu döngüyü sürdürür. Gereç ve Yöntem: Glioblastoma Multiform (GBM), tüm birincil beyin ve merkezi sinir sistemi neoplazilerinin %16'sını oluşturan, en yaygın birincil kötü huylu beyin tümörüdür. Glioblastomada, nöronların, eksitotoksisite yolu ile öldüğü bilinmektedir. Glutamat alınımından çoğunlukla Glutamat Transporter 1 (GLT-1) diğer adıyla Eksitatör Amino Asit Taşıyıcısı 2 (EAAT2) sorumludur. EAAT2'nin aktivitesinin azalması, glutamat birikimine yol açar. Bu birikim, hücre içi Ca+2 konsantrasyonunda yükselme ve hücresel ATP seviyelerinde azalma yolunu takip ederek glutamat eksitotoksisitesine ve nöronların olası nekrozuna sebep olur. Bulgular: Sirtuinler, proteinleri deasetilasyon veya ADP-ribosilasyon yoluyla posttranslasyonel olarak modifiye eden; çekirdek, mitokondri veya sitoplazmada ifade edilen enzimlerdir. Sirtuin 4 (SIRT4), beyinde de ifade edilen bir mitokondriyal sirtuindir. Daha önce, SIRT4'ün farede delesyonunun, bir eksitotoksik ajan olan kainik aside karşı hassasiyeti arttırdığı ve GLT-1'e bağlı glutamat alımını azalttığı gösterilmiştir. Yapılan diğer çalışmalarda ise SIRT4'ün, hücre dizilerinde, glutamate metabolizmasını modüle ederek, eksitotoksisiteyi engellediği gösterilmiştir. Glutamat metabolizması modülatörlerinin glioblastoma tümörlerindeki ifadesinin belirlenmesi; hastalığın tespiti, prognozu, mekanizması ve ilerleyişini anlamak için yol gösterici olacaktır. Sonuç: Bu çalışmada 84 adet primer tümörlü beyin dokusu (parafinli kesit), 12 adet kontrol beyin dokusu (parafinli kesit) alınmıştır. Parafinli doku kesitlerinden, RNA izolasyon kiti kullanılarak ve protokole uyarak total RNA çıkarılmıştır. Nanodrop ile RNA konsantrasyonları ve kalitesi ölçüldükten sonra cDNA sentez kiti kullanılarak ve verilen protokole uyularak cDNA elde edilmiştir. Elde edilen cDNA, glutamat dehidrojenaza (GDH), glutamin sentetaz (GS) ve Sirtuin4 (SIRT4)'e özgü primerler kullanılarak ve qPCR (quantitative PCR-kuantitatif polimer zincir reaksiyonu) kit protokolüne uyularak mRNA elde etme işlemine tabi tutulmuştur. Elde edilen GDH, GS ve SIRT4 mRNA'ları, beta aktin mRNA'sına oranlanarak normalleştirilmiştir. Daha sonra istatiksel analizde iki örnek grubunun ortalamaları arasındaki fark için Two-Tailed Unpaired, Student's t-test kullanılmıştır. Grup sayısı üç ve üzerinde olan durumlar için ise OneWay ANOVA testi kullanılmıştır.
GLT-1 (Glutamat transporter 1) yıkım yolağının, SIRT4 (Sirtuin 4) ile düzenlenmesinin, glia ve glioblastoma hücrelerinde araştırılması
Amaç: Çalışmada glia ve glioblastoma hücrelerindeki Glutamat Taşıyıcı-1 (GLT-1) yıkım yolağının SIRT4 ile düzenlenmesinin aydınlatılması amaçlandı. Bu yolak içerisindeki GLT-1 protein ekspresyon seviyelerindeki değişim, PKC mRNA seviyeleri ve protein ifadesindeki değişim, pNedd4-2 seviyelerindeki değişim, SIRT4-PKC etkileşimi ve GLT-1'in post-translasyonel modifikasyonlardan ubikitinasyon ve asetilasyonunun gösterilmesi amaçlandı. Gereç ve Yöntem: İlk olarak IHA ve U87 hücrelerinde SIRT4 shRNA lentiviral partiküller kullanılarak SIRT4 susturulmuş gruplar elde edildi. Dört farklı hücre grubundaki PKC mRNA seviyeleri qPCR yöntemi kullanılarak, protein ifadesi miktarları ise Western Blot yöntemi kullanılarak belirlendi. Fosforile olmuş Nedd4-2 seviyelerini hücre grupları arasındaki değişimi Western Blot yöntemi kullanılarak gösterildi. Hücrelerden elde edilen SIRT4 proteini PKC antikoru kullanılarak, PKC proteinleri ise SIRT4 antikoru kullanılarak immünopresipitasyon edildi ve bu yöntem ile SIRT4-PKC etkileşimi gösterildi. Hücre gruplarından elde edilen GLT-1 proteinleri kullanılarak yapılan immünopresipitasyon yönteminde, GLT-1'in ubikitinasyon ve asetilasyon seviyeleri belirlendi. Bulgular: Hücrelerdeki SIRT4, shRNA lentiviral partikül ile susturulduktan sonra IHA kontrol hücreleri, SIRT4 susturulmuş IHA hücreleri, U87 kontrol hücreleri ve SIRT4 susturulmuş U87 hücreleri olmak üzere dört grup elde edildi. Bu dört hücre grubunda SIRT4 ekspresyon seviyelerine bakıldı ve susturma işleminin başarıyla gerçekleştirildiği gösterildi. SIRT4 susturulması sonrasında glioblastoma hücrelerinde GLT-1 dimer ve trimer ekspresyonunun azaldığı, monomer ifadesinin değişmediği ve GLT-1 ubikitinasyonunun arttığı bulundu. Glia hücrelerinde ise SIRT4 susturulması sonrasında GLT-1 monomer, dimer, trimer ve ubikitinasyon seviyelerinin değişmediği bulundu. Nedd4-2 fosforilasyonunun ve PKC ekspresyonunun glioblastoma hücrelerinde değişmediği ancak glia hücrelerinde arttığı gösterildi. Ayrıca SIRT4'ün PKC'yi deasetile ettiği bulundu. Tüm bu bulgular ışığında glia ve glioblastoma hücrelerinde GLT-1'in düzenlenmesinin farklı mekanizmalar ile gerçekleştirildiği sonucuna ulaşıldı. Sonuç: Söz konusu çalışmada, GLT-1'in glia ve glioblastoma hücrelerinde SIRT4 aracılığıyla düzenlenmesinin araştırılması yapılmış ve çeşitli sonuçlar elde edilmiştir. Bu sonuçlara göre hem glia hem de glioblastoma hücrelerinde SIRT4 susturulmasının hücre içinde farklı mekanizmaları etkilediği görülmüştür. Glia hücrelerinde SIRT4 susturulmasının GLT-1 ifadesi üzerinde etkisi görülmemektedir. Ancak glioblastoma hücrelerinde SIRT4 susturulması sonrasında GLT-1 düzenlenmesinde görülen değişiklikler bu yolağın eksitotoksisite için etkili olabileceğini düşündürmüştür.
Koşullandırılmış medyum ve kinin benzeri moleküllerin GBM hücreleri üzerindeki etkisinin hücresel ve moleküler analizleri
Efektif bir tedavi seçeneği mevcut olmayan Glioblastoma multiforme (GBM) merkezi sinir sisteminin en ölümcül kanseridir. GBM'in agresifliği ve invazivliği hastalığın kötü seyretmesine ve düşük toplam sağkalıma neden olmaktadır. Bu nedenle yeni anti-karsinojenik ajanların geliştirilmesi veya terapi seçeneklerini genişletecek moleküllerin tanımlanması araştırmacılar için önceliktir. Koşullandırılmış medyum tümör mikroçevresini simüle etmek için in-vitro çalışmalarda yaygın olarak kullanılır ve tümör özellikleri üzerindeki sekretom etkisine ilişkin mevcut anlayışımızı genişletme potansiyeline sahiptir. İlaç yeniden konumlandırılması, mevcut ilaçların kullanım amacı dışında kullanılmasına dayalı, sürecin zaman alıcı ve yüksek maliyeti olmadan ilaç geliştirme prosedürlerine katkıda bulunan yenilikçi bir yaklaşımdır. İyon kanalları, invazyon ve metastaz gibi kanserle ilgili birçok temel biyolojik süreçte ek kritik rollere sahip fizyolojik homeostazın birincil düzenleyicilerinden biridir. Bu çalışmada GBM hücrelerinin koşullandırılmış medyumlarının etkisi birbiri üzerinde denenmiştir ve hızlı sodyum kanal bloklayıcısı hidrokinidinin (HQ) anti-karsinojenik etkisi GBM hücreleri üzerinde test edilmiştir. Koşullandırılmış medyum ve hidrokinidinin etkisi yaygın olarak uygulanan hücre kültürü ve moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak değerlendirilmiştir. 48. saatte U87 veya LN229 hücrelerinden toplanan koşullandırılmış medyumun, gen ekspresyon profilini değiştirerek GBM hücrelerinin birbirleri üzerinde bir anti-büyüme aktivitesi sergilediğini gösterilmiştir. Ayrıca, LN229'un koşullandırılmış medyumu, U87 hücrelerinin göç kapasitesini azaltmış ve U87 hücrelerinin koşullandırılmış medyumu, LN229 proliferasyonunu önemli ölçüde bastırmıştır. HQ'nun temozolomid (TMZ) duyarlı ve dirençli GBM hücreleri üzerinde önemli bir anti-kanserojen etkisi, hücre döngüsü ve hücre ölümü ile ilgili değişen gen ekspresyon profiline bağlı olarak artan apoptoz ve azalan proliferasyon yoluyla gözlenmiştir.
Glioblastoma multiforme tümörlerinde miRNA-582-5P ve miRNA-363 ekspresyon seviyelerinin kaspaz-9 üzerine etkisi
The aim of this thesis study is to investigate the expression levels of microRNA-582-5p and miRNA-363 as they relate to serum levels of caspase-9, which holds key roles in the initiation of apoptosis in glioblastoma multiforme (GBM) patients. For this purpose, a total of 71 individuals, were selected and divided into two groups: those who were diagnosed with GBM disease (n=35),and those who were not previously diagnosed with this disease (n=36).The expression levels of miRNA-582-5p, miRNA-363 and caspase-9 gene Ex5+32 G>A (rs1052576) polymorphism of the groups were analyzed using real-time polymerase chain reaction. The miRNA expression analysis showed that miRNA-582-5p and miRNA-363 expressions were significantly downregulated in the patient group (p=0.014* and p=0.010*). When the means of serum miRNA-582-5p, miRNA-363 and serum caspase-9 levels were compared, a statistically significant relationship between miRNA expression levels and caspase-9 level could not be determined (p=0.144 and p=0.050). Also, caspase-9 gene Ex5+32 G>A (rs1052576) polymorphism was investigated in GBM patients, as well as undiagnosed individuals in the Turkish population. Having GG genotype reduced the risk of GBM by 3.78 times (p=0.015*). According to the results of ROC analysis, which is the last assessment point for biomarker nomination, it was observed that miRNA-582-5p and miRNA-363 are candidate biomarkers for GBM (miRNA-582-5p ΔCт p=0.006*; fold change p= 0.0001* and miRNA-363 ΔCт p=0.0016*; fold change; p=0.0001*). In conclusion, while a statistically significant relationship was found between miRNA-582-5p, miRNA-363 expression levels and working groups, no statistically significant relationship was found between miRNA-582-5p and miRNA-363 expression levels regarding an effect on serum caspase-9 levels.