Gıdalarda bulunan çeşitli bakteriler için türe özgü primerlerin dizayn edilmesi

Bu çalışma, gıda güvenliği açısından kritik öneme sahip olan patojen bakterilerin hızlı, spesifik ve hassas bir şekilde tespit edilmesi amacıyla türe özgü primerler tasarlamayı ve bu primerlerin Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) tekniği kullanılarak laboratuvar koşullarında etkinliğini değerlendirmeyi hedeflemiştir. Gıda kaynaklı hastalıkların önlenmesi, halk sağlığının korunması ve gıda endüstrisinin güvenilirliğinin sürdürülebilirliği açısından bu tür moleküler tanı yöntemlerinin geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Çalışmada, özellikle Salmonella spp., Escherichia coli, Listeria spp. ve Bacillus spp. ait önemli bakteri türlerine yönelik primer dizaynları yapılmış ve bu primerlerin spesifikliği, duyarlılığı ve amplifikasyon verimliliği deneysel olarak test edilmiştir. Primer tasarımında 16S rRNA geni gibi korunmuş bölgelerin yanı sıra türe özgü genler (örneğin bceT, cytK, prs, iap, iroN ve uspA) hedef alınmıştır. Primerlerin optimizasyonu için farklı bağlanma sıcaklıkları (annealing) ve PZR koşulları denenmiş, başarılı sonuçlar elde edilen primerler belirlenmiştir. Bu çalışmada, Bacillus türlerinin tespiti için tasarladığımız bceT genine özgü primerler, 51°C bağlanma sıcaklığında başarılı bir şekilde amplifikasyon sağlamıştır. Ancak aynı bakteriler için hazırladığımız cyt/hk ve tuf gen primerleri beklenen sonucu vermediği gözlemlenmiştir, yani bu primerler hedef DNA'yı çoğaltamamıştır. Salmonella Typhimurium analizlerde ise farklı genler için değişen sonuçlar alınmıştır. iroN geni 54°C'de güzel bir şekilde çalışırken, bigA geni için 57°C ve 59°C sıcaklıkların daha uygun olduğu saptanmıştır. iacP geni ise ilginç bir durum gösterdi; standart PZR'da sonuç alınamamış olup gradient PZR yöntemiyle başarılı olunmuştur. Listeria monocytogenes identifikasyonu için geliştirilen iap ve prs gen primerleri, çalışılan tüm deneysel parametrelerde amplifikasyon gerçekleştirememiştir. Bu durum, primer sekanslarının yeniden optimize edilmesi gerekliliğini veya hedef bölgelerdeki genetik polimorfizmleri düşündürmektedir. Escherichia coli tanımlamasında kullanılan uspA geni primerleri, literatürde belirtilen protokole uygun olarak başarılı şekilde çalışmış ve bu genin tür spesifik tanımlamada güvenilir bir moleküler markır olduğu doğrulanmıştır. Elde edilen bulgular, tasarlanan primer setlerinin bir bölümünün gıda kaynaklı patojenlerin tanımlanmasında etkili olduğunu, ancak bazı primerlerin fizikokimyasal parametreler açısından yeniden optimize edilmesi gerektiğini ortaya koymuştur.