Selective enrichment of glycoproteins using magnetic microspheres and their sensitive detection with surface enhanced Raman spectroscopy

Glikoproteinler metabolizmada hücre-hücre etkileşimi, sinyal iletimi, protein katlanması, molekül tanıma ve konakçı-patojen etkileşimi gibi konularda kritik rol oynamaktadır. Ayrıca, ilaç endüstrisinde ilacın kararlılığı, farmokokinetik ve imunojenik özellikleri üzerindeki etkisi sebebiyle glikoproteinler sıklıkla kullanılmaktadır. Antikor ve antikor türevli moleküller ilaç endüstrisinin başlıca üyelerindendir. Antikorların en popülerlerinden biri de İmmunoglobulin G (IgG) glikoproteini olup, yüksek saflıkta üretimi önemlidir. Çalışmanın ilk bölümünde, kompleks serum ortamından IgG glikoproteinini saflaştırmak için manyetik, silika temelli bir sorbent kullanılmıştır. IgG saflaştırmak amacıyla pH-bağımlı diol gruplarına seçimli bağlanmayı sağlayan bir sistem olarak sorbent, amino fenil boronik asit (APBA) grubu ile fonksiyonalize edilmiştir. Adsorpsiyon-desorpsiyon mekanizmaları incelenmiş ve optimum koşullar araştırılmıştır. Bağlayıcı tampon çözelti olarak 0.05 M pH 8.5 HEPES kullanılmıştır. IgG adsorpsiyon davranışı Langmuir modeli ile uyumlu bulunmuştur; bu da adsorpsiyonun tek tabaka halinde ve homojen olarak gerçekleştiğini göstermektedir. IgG maksimum adsorpsiyon kapasitesi 84 mg.g-1 olarak hesaplanmıştır. Adsorpsiyon işleminden sonra glikoproteini saflaştırmak için en iyi desorpsiyon ortamı incelenmiştir. IgG'nin optimum izolasyonu 0.2 M NaCl içeren 1 M Tris-Cl (pH: 8.5) desorpsiyon ortamında 5 mg sorbent kullanarak elde edilmiştir. Saflaştırma işleminden sonra serum içerisindeki IgG glikoproteini 4 kat konsantre edilmiş olup, elüsyonlarda 80% saflığında IgG gözlenmiştir. Çalışmanın ikinci kısmında ise, etkili bir saflaştırma işleminden sonra; patojen tanısı, kanser, diyabet gibi günümüz hastalıklarının erken teşhisi ve etkili farmasötiklerin geliştirilmesi kapsamında önemli bir araç olan glikan yapıların hassas ve hızlı tayini incelenmiştir. Bu amaçla, diol gruplarına seçimli olarak bağlanmayı sağlayan merkapto fenil boronik asit (MPBA) ile fonksiyonalize edilmiş gümüş kabuğa sahip manyetik polimetakrilat mikroküreler (MPBA-Ag@MagPMMS) yardımıyla Yüzeyce Zenginleştirilmiş Raman Spektroskopisi (SERS) tekniği kullanılmıştır. Model protein olarak birbirine oldukça benzer yapıda olan RNase A proteini (negatif kontrol) ve RNase B glikoproteini bu özel sandviç sistemiyle kullanılmıştır. Adsorplanan glikoproteinlerin karakterizasyonu ve nicel ölçümü bu teknikle gerçekleştirilmiştir. Bu yöntemle, 0.1 ng/mL, yaklaşık 10-15 M, derişim seviyesine kadar RNase B tayini kolaylıkla yapılabilmiştir