Expression profiling of Helicobacter-activated regulatory B cells

Bakteri, virüs, funguslar gibi yabancı organizmalara ve immün hücreleri tarafından yabancı olarak tanınan antijenlere karşı immün sistem ilk savunmayı sağlar. Vücudumuzdaki her an immün sistem bir çok farklı antijen ile karşılaşır. Bu nedenle, immün sistem bu farklılıkları ayırt etme yeteneğine ve uygun bir şekilde yanıt oluşturma yeteneğine sahiptir. Genel olarak immün sistem hücreleri, doğal ve sonradan kazanılan immün sistem altında yer alır. Doğal immün sistemin üyeleri olan hücreler, bir patojene karşı spesifik olmayan ilk yanıtı oluşturur ve çoğunlukla bu yanıt enflamasyona neden olur. Ayrıca, en önemli doğal immün sistem hücreleri lokal enfeksiyonlara hızlı bir şekilde yanıt veren nötrofiller ve makrofajlardır. Öte yandan, sonradan kazanılan immün sistem hücreleri, spesifik hücre yüzey markırlarına sahip olan T ve B hücrelerini içerir. Bu hücrelerin spesifik bir yabancı antijeni tanıması için belirli bir sürenin geçmesi gerekmektedir. Doğal ve sonradan kazanılmış immün sistem, Helicobacter gibi patojenlerin ortadan kaldırmak için bir düzen içinde çalışır. Helicobacter pylori (H. pylori) seçici olarak gastrik epitelde kolonize olan gram negatif bakteridir. H. pylori enfeksiyonu dünyadaki en yaygın bakteriyel enfeksiyondur. Dünya popülasyonunun yarısından fazlası, yaklaşık olarak yetişkin bireylerin %60'ı ve çocukların %30'u H. pylori ile enfekte durumdadır. Kesin kanıtlar, Helicobacter enfeksiyonunun bir defa kazanıldığında antimikrobiyal tedavi ile ortadan kaldırılmadıkça yaşam boyu devam ettiğini göstermektedir. H. pylori gastrik mukoza hücrelerinde lokalize olur. H. pylori ile enfekte tüm bireylerde genellikle semptom vermeyen kronik gastrik enflamasyon gözlenmektedir. Cag-PAI ve vacA gibi genlerinin varlığı gastrik atrofi, gastrik adenokarsinom gelişimi, konağın mukozal dokusunda aktive olan immün hücrelerin toplanması riskini arttırmaktadır. Ayrıca, yakin zamanda gerçekleştirilen bir calışmada H. pylori ile enfekte grubun H. pylori-negatif grup ile karşılaştırıldığında 1.7-5.3 kat daha fazla bağıl gastrik kanser riskine sahip oldugu gösterilmiştir. H. pylori'nin konak lenfositleri ve antijen sunan hücreler ile etkileşim mekanizması karmaşıktır. Bu nedenle, regülatör B ve T hücreleri immün patojenite ve koruma arasındaki denegenin kurulmasında önemli bir role sahiptir. Son zamanlarda, regülatör T hücrelerinin farelerdeki H.pylori ile indüklenen gastriti azalttığı gösterilmiştir. Aynı zamanda, regülatör T hücreleri bakterinin mukozada yüksek oranda kolonize olmasına da izin verir. Bununla beraber, enfekte bireylerde H. pylori-spesifik CD4+ CD25+ regülatör T hücreleri H. pylori'ye karşı gelişen hafıza T hücre cevabını baskılamaktadır. Ayrıca, Helicobacter ile ilişkili immün yanıtta regülatör B hücrelerinin rolü de araştırılmıştır. IL-10 üreten B hücreleri TLR-2/Myd88 yolağı aracılığıyla aktive olmaktadır. Bununla birlikte, IL-10 üreten B hücreleri, naif T hücrelerinin tip-1 regülatör T (Tr1) hücrelerine farklılaşmasına neden olmaktadır. Tr-1 ve IL-10 üreten B hücreleri arasındaki etkileşim, pre-kanseröz lezyonları xxx engelleyebilir ve Helicobacter'e karşı iyi bir immün düzenleyici olarak işlev görebilir. İlk olarak, laboratuvarımızdaki önceki çalışmalarda H. felis-stimüle (Hfstim) B hücrelerinin fenotipleri çalışılmıştır. Bu bağlamda, H. felis ile etkileşimin ardından iki Breg alt grubunun oluştuğu gösterilmiştir: Hfstim-IL-10+ B and Hfstim-IL-10– B hücreleri. Her iki hücre alt grubu farklı hücre yüzey markırları ve sitokin profilleri ile tanımlanmıştır. Ayrıca, Hfstim-IL-10+ B ve Hfstim-IL-10– B hücrelerinde tümör nekroz alfa (TNF-α) ve interlökin 6 (IL-6) sitokinleri araştırılmıştır. Hfstim-IL-10- B hücrelerinde, Hfstim-IL-10+ B hücreleri ile karşılaştırıldığında, TNF-α ve IL-6 sitokinleri mRNA ve protein düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı olarak eksprese edilmişir. Laboratuvarımızda gerçekleştirilen son zamanlardaki çalışmalar ve Müller'in elde ettiği veriler, bizi Hfstim-Breg'lerin naif CD4+ T hücreleri üzerindeki fonksiyonel rolünü araştırmaya teşvik etti. Buna ek olarak, son zamanlarda gerçekleştirilen çalışmalarda, RNA-seq ve mikroarray teknikleri aracılığıyla B10 hücrelerinin transkriptom analizleri yapılmıştır. LPS ile muamele edilmiş B10+ ve B10- hücrelerinde farklı düzeylerde eksprese edilen genler tanımlanmıştır. Bu çalışmamızda Hfstim-Breg'lerde son zamanlarda tanımlanmış genlerin ekspresyon düzeylerini araştırmayı amaçladık. İlginç bir şekilde, son tanımlanan genler CD9, STAT1, PDCD1(PD-1) ve NRP2'dir. Çalışmamızda stimüle edilmeyen B hücreleri, Hfstim-B hücreleri, Hfstim-IL-10+ B ve Hfstim-IL-10- B hücreleri olmak uzere 4 grup bulunmaktadir. Dolayısıyla, ilk olarak, mikroarray analizi ile Helicobacter ile stimüle edilen regülatör B hücrelerinin ekspresyon profilinin ortaya çıkarılmasına odaklandık. Daha sonra, IL-10 üreten regülatör B hücrelerinin gen ekspresyon profili, B hücrelerinin immün fonksiyonu ile ilişkili spesifik genleri ve transkripsiyon faktörlerini kodlayan genlere yönelik detaylı bir veri sağlayacaktı. Mikroarray verilerimiz, IL-10– B hücreleri ile karşılaştırıldığında IL-10+ B hücrelerinde 1615 genin ekspresyonunun artarken 794 genin ekspresyonunun azaldığını göstermektedir. Son zamanda çıkan bir çalışmada, IL-10+ B hücrelerinin CD9 ve PDCD1 genlerini yüksek düzeyde eksprese ettiklerini göstermiştir. Mikroarray ve gerçek zamanlı PZR verilerine dayanarak, iki diğer aday gen (S100A8 ve Trib1) ile beraber CD9, PDCD1 ve NRP2 genlerinin Hfstim-IL-10+ B ve Hfstim-IL-10– B hücrelerinde farklı ekspresyonlara sahip olduğunu saptadık. Daha sonra, Hf stim-IL-10+ and Hfstim-IL-10– B hücrelerinde PD-1 ve CD9 molekülleri protein düzeyinde akan hücre ölçer analizi ile araştırılmıştır. PD-1 ve CD9 protein düzeyleri, Hfstim-IL-10+ B hücrelerinde Hfstim-IL-10– B hücreleri ile karşılaştırıldığında anlamlı bir şekilde daha yüksek gözlenmiştir. Bununla birlikte, Hfstim-IL-10+ Breg'lerde PDCD1 ekspresyonunun doğrulanması bizim ikinci amacımızdı. Bu bağlamda, B hücrelerinde ekspresyonu artan PD-1'in PD-1/PDL1 etkileşimi ile Tr1 indüklenmesindeki rolünün anlaşılabilmesi ile ilişkili PD-1 için fonksiyonel çalışmalar, PD1/PD-L1 etkileşiminin bloke edilmesi ile gerçekleştirilmiştir. Akan hücre ölçer analizleri; CD9, CD19, IL-10, PD-L1, and PD-L2 molekülleri için gerçekleştirilmiştir. PD-1 ve ligandı PD-L1 Hfstim-IL-10+ B hücrelerinde Hfstim-IL-10– B hücrelerine göre daha yüksek düzeylerde eksprese edilmektedir. Bu bağlamda, B hücre ve naif CD4+ T hücre ko-kültüründen önce Hfstim- IL-10+ B veya Hfstim-IL-10– B hücrelerinde PD-1 veya PD-L1 bloke edilmiştir. PD-1/PDL-1 yolağının bloke edilmesi için anti-PD-1 veya anti-PD-L1 kullanılmıştır. PD-1 molekülü bloke edilen Hfstim-IL10+ B hücrelerinde, PD-1 molekülü bloke edilen Hfstim-IL10– B hücrelerine göre daha düşük oranda IL-10+ CD4+ T hücrelerini indüklemiştir. PD-1/PD-L1 yolağının bloke xxxi edilmesinin ardından IL-10'un CD4+ T hücrelerinde ekspresyonunun azalması, PD-1+ B hücrelerinin Tr1 gelişimindeki rolünü vurgulamaktadır. Önceki çalışmalar PD-1+ CD4+ T hücrelerinin IL-10 üreten T hücrelerinin gelişimini etkilediğini göstermiştir. Çalısmamızda, naif CD4+ T hücrelerinde PD-1 ve PD-L1 ekspresyonlarını gösterdik. Dolayısıyla, PD-1+ CD4+ T veya PD-L1+CD4+ T hücrelerinin Breg'ler ile etkileşimi süresince Tr1 hücrelerinin gelişiminin araştırılması amacıyla, Hfstim-IL-10+ B / Hfstim-IL-10– B hücreleriyle ko-kültürden önce CD4+ T hücrelerinde PD-1 veya PD-L1 molekülleri bloke edildi. Bu aşamada, Breg'ler ile ko-kültürün öncesinde CD4+ T hücrelerinde PD-L1 molekülünün bloke edilmesi, indirekt olarak Breg'lerde PD-1 molekülünün bloke edilmesiyle gerçekleştirildi. İlginç bir şekilde, Hfstim-IL-10+ B hücrelerinde PD-1'in veya CD4+ T hücrelerinde PD-L1'in bloke edilmesi, benzer bir şekilde CD4+ T hücrelerinde IL-10 ekspresyonunun azalmasına neden olmuştur.Bütün bu veriler ile Hfstim-PD-1+ Breg'lerin Tr1 hücrelerinin indüklenmesinde potansiyel bir role sahip olduğunu gösterdik. Aynı zamanda, naif CD4+ T hücrelerinin Hfstim-PD-1+ Breg'ler ile etkileşimi süresince gerçekleştirilen PD-1/PD-L1 blokağı, bozulmuş bir immün yanıta olanak vermiştir. Gerçekten, immün yanıtı güçlendirmek ve Helicobacter ile induklenen gastrik kanserin ilerlemesinin engellenmesi için PD-1+ Breg hücreleri, terapötik bir hedef olarak kullanılabilir. Şu anda, PD-1 ekspresyonu H. pylori ile enfekte hastaların özellikle CD4+ T hücrelerinde gösterilmiştir. Ayrıca, H. pylori yoğunluğu ile CD4+ PD-1+ T hucre veya CD4+ CD25hi Treg sıklığı arasında anlamlı ilişki de gösterilmiştir. Bu nedenle, Helicobacter ile enfekte gastrik dokuda PD-1 mRNA ekspresyonu konusunda çalışmalar yaptık. Bu çalışmalarda, gastrik dokunun H. pylori ile enfeksiyon durumu daha önceden laboratuvarımızda üre A ve üre B gerçek zamanlı PZR yöntemi ile doğrulanmıştır. Dolayısıyla, H. pylori-negatif bireylerde ve H. pylori ile enfekte gastrit ve ülser hastalarında gerçek zamanlı PZR aracılığıyla PD-1 ekspresyon düzeylerini belirledik. İnsan PD-1 mRNA düzeylerinin H. pylori ile gastrik dokuda farklı bir şekilde eksprese edildiğini gösterdik. Ülser hastalarında, gastrit hastaları ile karşılaştırıldığında anlamlı bir PD-1 mRNA ekspresyonu gözlenmiştir. Bu veriler, H. pylori ile enfekte gastrik dokuda insan PD-1 molekülü ile ilgili bir ön çalışma niteliğindedir. Laboratuvarımızdaki gelecek çalışmalar H pylori ile enfekte bireylerin gastrik dokularinda PD-1 ile IL-10 üreten B hücreleri veya IL-10 üreten T hücreleri arasındaki ilişkiyi araştıracaktır.