The effect of Helicobacter felis on macrophage polarization

Helicobacter pylori (H. pylori), mide kanserinin gelişimine neden olan en önemli risk faktörlerinden birisi olarak tanımlanmıştır. Türkiye'nin dahil olduğu gelişmekte olan ülkelerde bireylerin %80'i H. pylori ile enfekte durumdadır. Ancak, enfekte bireylerin sadece %20'si gastrit, ülser veya mide kanseri gibi gastrik komplikasyonlar göstermektedir. H. pylori enfeksiyon patogenezi ile ilgili birçok durum hücre kültürü deneyleri ve fare modelleri kullanılarak aydınlatılmaya çalışılmaktadır. Helicobacter felis (H. felis), spiral şekilli, gram negatif bir bakteridir. Fare modellerinde, H. pylori'nin yanı sıra onunla aynı aileden ve farelerde immünojenliği daha yüksek olan H. felis yaygın şekilde kullanılmaktadır. C57BL/6 fare modellerinde H. felis'in kronik enfeksiyonunun pre-neoplastik patolojiyi tetiklediği gösterilmiştir. Histolojik olarak mide atrofisi, pit hücre hiperplazisi ve intestinal metaplazi ile karakterizedir. H. felis normalde H. pylori'nin bulundurduğu önemli virulans faktörlerini taşımamaktadır. Buna rağmen, fare modellerinde H. pylori'den daha ağır mide inflamasyonlarına sebep olmaktadır. H. pylori'ye karşı proinflamatuar doğal immün cevap makrofajlar, nötrofiller ve dendritik hücreler tarafından sağlanmaktadır. Makrofajlar heterojenik ve dinamik hücrelerdir ve gerekli durumlarda, farklı uyaranlara cevap olarak farklı tiplere polariza olabilirler. Polarizasyon durumu, uyaranlara ve yerel mikro-çevrenin durumuna göre değişiklik gösterir ve makrofajların değişen ortama uyum sağlamasına olanak sağlar. Farklı uyaranlar tek dokularda tek başlarına var olmazlar ve makrofajlar sadece tek bir tipe polarize olup, tek tipte klonal olarak çoğalmayabilirler. Makrofajların farklı fonksiyonları; uyaranlara, mikro-çevreki sitokin profiline göre ve uyaranların farklı reseptörler ile tanınması ile ilişkilidir. Klasik olarak aktive edilmiş makrofajlar (M1 tip) ve alternatif olarak aktive edilmiş makrofajlar (M2 tip) olmak üzere iki genel makrofaj polarizasyon fenotipi bulunmaktadır. Bu fenotipleri sadece hücre yüzey belirteçleri sayesinde karakterize etmek mümkün değildir. Bu yüzden, makrofajlar hücre yüzey belirteçlerinin yanı sıra, spesifik fonksiyonları ve ürettikleri sitokin profilleri incelenerek kategorize edilmelidirler. Klasik olarak aktive edilmiş (M1 tip) makrofajlar proinflamatuar efektör doğal immün cevap hücreleridir. Bu hücreler GM-CSF, LPS ve IFN- ile aktive olurlar ve yüksek miktarlarda TNF-, IL-1, IL-6, IL-12/ IL-23 proinflamatuar sitokinlerini salgılarlar. Anti mikrobiyal fonksiyonları, iNOS enzimi tarafından üretilen nitrik oksit (NO) ile ilişkilidir. M1 tipi makrofajlar profesyonel antijen sunan hücrelerdir ve yüksek miktarlarda MHC sınıf I ,sınıf II antijenleri ile beraber, CD40, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2) yardımcı uyaran molekülleri ve fagositoz aktivasyonu için kompleman sistemi proteinlerini eksprese ederler. Aynı zamanda, hücre yüzey belirteçlerinden CD11c'nin M1 tipi makrofajlarda eksprese edildiği obesite çalışmasında kanıtlanmıştır. Alternatif olarak aktive edilmiş (M2 tip) makrofajlar immün baskılama ve doku onarımında görev alırlar. Bu hücreler IL-4 veya M-CSF ile aktive olurlar. Genelde yüksek miktarda anti-inflamatuar IL-10 sitokin salgılaması, IL-1RA ekspresyonu, CD206 yüzey belirteci ekspresyonu ve düşük miktarda IL-12/ IL-23 sitokini salgılaması ile karakterizedirler. M2 tip makrofajlar, M2a, M2b ve M2c olarak üç alt gruba ayrılırlar. M2a alt tipi IL-4 veya IL-13 sitokinleri ile uyarılırlar. M2b alt tipi IL-1R ligandı ve/veya LPS ve immünkompleksleri ile uyarılırlar. M2c alt tipi ise IL-10, TGF- ve glukokortikoid hormonları ile uyarılırlar. Dördüncü M2d (TAM) tipi makrofajlar ise yüksek IL-10 ve düşük IL-12 sekresyonu ile karakterizedirler. Bu makrofajların fenotipik and fonksiyonel özellikleri M2a-c tipi makrofajlardan farklıdır. Fonksiyonları arasında immün cevabın baskılanması, düşük tümörisidal aktivite, doku yenilenmesi ve anjiyogenez bulunmaktadır. Literatürde bazı çalışmalarda H. pylori'nin makrofajlar üzerindeki bazı etkileri gösterilmiştir. İlk çalışmalarda, H. pylori'nin makrofajlarda iNOS ekspresyonunu indüklediği, aynı zamanda IL-6, IL-8, TNF-α, IL-1-β gibi proinflamatuar sitokinlerin salgılanmasını sağladığı gösterilmiştir. Fakat, yakın zamandaki insan mide biyopsileri ile gerçekleştirilen çalışmalarda, H. pylori pozitif hastaların dokularında CD163+ (alternatif olarak aktive edilmiş (M2 tip) makrofaj) makrofajlara rastlanmıştır. Ayrıca, H. pylori enfekte insanların monositlerinden IL-1, IL-6, ve IL-12p40 proinflamatuar sitokinlerin yanı sıra, anti-inflamatuar IL-10 salgılandığı gösterilmiştir. Başka bir deyişle, M2 tipi makrofajlar yukarı regüle edilmiştir ve yüksek miktarda anti-inflamatuar sitokinler ile M1 tipi makrofajlara kıyasla daha düşük miktarda pro-inflamatuar sitokinlerin salgılandığı gözlemlenmiştir. H. pylori'ye karşı edinsel immün cevap, doğal bağışıklık hücrelerinin salgıladıkları sitokinler, antijen sunan hücrelerinin edinsel bağışıklık hücreleri ile etkileşimleri ve mikro-çevredeki değişimler sayesinde aktive olur. Pre-neoplastik patoloji, sadece enfeksiyon tarafından değil (örneğin 'bakteriyel onkoprotein' olarak davranan Helicobacter virulans faktörleri aracılığıyla), aynı zamanda local CD4+ efektör T hücrelerce (Th-1) üretilen interferon- aracılığıyla oluşur. Th-1 hücrelerinin yanı sıra proinflamatuar Th-17 hücreler de Helicobacter patolojisinde rol almaktadır. Th-17 hücre grubu IL-23, IL-1, ve IL-6 sitokinleri tarafından uyarılır. Helicobacter- enfekte farelerde, CD4+ efektör T hücreleri regülatör T hücre (Treg) popülasyonunun sıkı kontrolü altındadır. Treg'lerin eliminasyonu mide patolojisini kötüleştirir. Treg hücre grubunun yanı sıra, yakın zamanlarda, fare dalağından izole edilen B hücrelerinin Helicobacter enfeksiyonunda IL-10 ürettiği ve salgıladığı in vivo ve in vitro çalışmalarda gösterilmiştir. Helicobacter –asosiye mide patolojisinin baskılanmasında Helicobacter –aktive regulatör B hücrelerinin (Hsps Breg) rolü gösterilmiştir. Bu IL-10 üreten regülatör B (Breg) hücreleri, C57BL/6 faresindeki Helicobacter kaynaklı yüksek Th1 dominant immün cevabı baskılamaktadır. Uyarılan Helicobacter spesifik- Breg hücre grubu, naif T hücrelerinin IL-10 üreten CD4+CD25+ T regülatör-1 (Tr-1) hücrelerine farklılaşmasını sağlayarak, Helicobacter- kaynaklı gastrik patolojiyi in vivo ve in vitro'da baskılamaktadır. Aynı zamanda, Helicobacter enfekte hastaların serumlarında, Helicobacter- spesific IgM, IgA ve IgG antikorlarına rastlanmıştır. Yukarıda bahsi geçen bilgiler H. pylori'nin makrofajlar üzerindeki bazı etkilerini ortaya koymaktadır. Fakat, halen H. pylori ya da H. felis'in makrofaj üzerindeki etkilerinin kesin olarak karakterize edildiği bir bilgi bulunmamaktadır. Bu sebeple, çalışmamız, Helicobacter felis'in kemik iliği kökenli makrofajların (Kİ- kökenli makrofajlar) ve peritoneal makrofajların polarizasyonu üzerindeki etkisini incelemeyi amaçlamaktadır. Bu etki, M1 ve M2 tipi makrofajlara özgü yüzey belirteçlerinin ve sitokin profillerinin aralarındaki farklılıklar baz alınarak açıklanmıştır. Bu sebeple, C57BL/6 tipi farelerin uzuv kemiklerinden elde edilen kemik iliği hücreleri, L929 hücresince üretilen M-CSF varlığında ex vivo ortamda Kİ- kökenli makrofajlarına çevrilmiştir. Peritoneal makrofajlar ise thioglycollate enjekte edilmiş C57BL/6 farenin periton boşluğundan izole edilmiştir. Kİ- kökenli makrofajlarına farklılaşmanın teyidi ve peritoneal makrofajların saflığının teyidi için, makrofaj spesifik anti-F4/80 ve anti-CD11b antikorlarıyla sağlanmıştır. Ardından, elde edilen makrofajlar, bakteriyel lipopolisakkarit (LPS) ve Helicobacter felis (H. felis) sonikatı ile, 24 saat süresince muamele edilmiştir. Hücre peletleri hücre aktivasyon belirteci (CD40, CD80 ve CD86) boyamaları ve M1 ve M2 tipi spesifik belirteçleri (sırasıyla, CD11c ve CD206) boyamaları için ve IL-12/IL-23 (p40), TNF-, IL-1, IL-10, IL-6 ve iNOS sitokinleri için gerçek zamanlı PZR testleri için kullanılmıştır. Hücre süpernatanları ise IL-12/IL-23(p40), TNF-α, IL-1β ve IL-10 spesifik ELIZA testleri ile NO sekresyonu tayini için griess bileşim protokolü testi için kullanılmıştır. Gerçekleştirilen deneylerin sonucunda, kemik iliği hücrelerinin ex vivo ortamda, %90'ın üzerinde saflıkla Kİ- kökenli makrofajlarına dönüştüğü, ve peritoneal makrofajların yine %90 üzerinde saflıkla izole edildiği, makrofaj spesifik F4/80 ve CD11b yüzey belirteçleri ile teyit edilmiştir. Aktivasyon belirteci boyamaları sonucunda, Kİ- makrofajları ile peritoneal makrofajlar, muameleden bağımsız olarak yüksek miktarlarda CD40 ve CD80 yüzey belirteci eksprese ettikleri gözlemlenmiştir. Bunun yanında, belirleyici olarak CD86 belirteci, muamele görmeyen gruba kıyasla, H. felis sonikatı ile muamele gören Kİ- kökenli makrofajlarından ve peritoneal makrofajlarından yüksek miktarda eksprese edilmiştir. Yapılan deneylerde, CD86 antikoru ile belirlenen aktivasyon statüsünün, CD11c ve CD206 antikorları ile belirlenen sırasıyla M1 tipi ve M2 tipi makrofajlara polarizasyonu statüsünün arasında bir ilişki gözlemlenememiştir. polarizasyon statüsünün karakterizasyonu için, yüzey belirteçlerinin yanı sıra aktif makrofajların sitokin profilleri de incelenmiştir. Bu incelemeler sonucunda, Helicobacter felis sonikatı ile muamele edilen kemik iliği ve peritoneal makrofajlarının yüksek düzeyde IL-10 sitokini üretmeleri ve NO üretmemelerinden dolayı, M2 tipine benzer fenotip sergilediği gösterilmiştir. Aynı zamanda, Helicobacter felis sonikatı ile muamele edilen bu makrofajların, muamele edilmeyen gruba göre, yüksek oranda IL-12/IL-23(p40), TNF-α, IL-1β ve IL-6 sitokinlerini salgıladıkları ve eksprese ettikleri gözlemlenmiştir. Sonuç olarak, LPS ile muamele edilen Kİ- kökenli makrofajları, ex vivo ortamda, yüzeylerinde bulundurdukları yüksek miktardaki CD86 ile daha aktif, CD11c belirteci ve salgıladıkları IL-12/IL-23(p40), TNF-α, IL-1β, IL-6 sitokinleri ve NO üretmeleri dolayısıyla tarafımızdan M1 tipi makrofaj olarak sınıflandırılmıştır. Öte yandan, Helicobacter felis sonikatı ile muamele edilmiş Kİ-makrofajlarının, M2 tipi makrofajlara özgü CD206 yüzey belirteci bulundurmaları ve IL-10 sitokini salgılamaları dolayısıyla, M2 tipine benzer bir fenotip sergilediği önerilmektedir. Aktiflik statüsünün, makrofajların polarizasyonuna etki etmediği de yüzey belirteçleri ile belirlenmiştir. Ayrıca makrofajların TNF-α ve IL-1β sitokinleri ile beraber IL-6 sitokinini salgılamaları ile beraber literatürde bilinen M2b fenotipi makrofajlara polarize oldukları gözlemlenmiştir. Bu makrofajların aynı zamanda M1 tipi makrofajlara özgü IL-12/IL-23(p40) sitokini de ürettikleri gözlemlenmiştir. Çalışmalarımızın sonucunda, Helicobacter felis sonikatı ile muamele edilmiş Kİ- makrofajlarının, M2b ve M1 tipine benzeyen hücrelere farklılaştıkları önerilmektedir.