The role of chemerin in Helicobacter pylori induced gastric pathogenesis

Helicobacter pylori (H. pylori), insan gastik epitelinde kolonize olan, gram negatif, spiral-şekilli, mikroaerofilik, kamçılı bir bakteridir. Bu bakteri, kronik gastrit, gastrik adenokarsinom, peptik ülserler ve gastrik lenfomalar gibi gastrik hastalıkların gelişimiyle olan bağlantısından dolayı Tip I karsinojen olarak sınıflandırılmaktadır. Dünya nüfusunun %50'si H. pylori ile enfekte olduğu halde, enfeksiyonların büyük bir çoğunluğu, patojenin güçlü doğal ve edinsel bağışıklık cevaplarından kaçınabilme yeteneğinden ötürü, semptomlara veya gastrointestinal hastalıklara yol açmamaktadır. Bakteriler nadiren tamamen yok edilir, kolonizasyon genel olarak ömür boyu sürer, ve enfeksiyon hem doğal, hem de edinsel bağışıklı cevaplarını içerir. Kemerin (chemerin), katelisidin/sistatin ailesinden bir proteindir ve G proteinine bağlı reseptör CMKLR1 ( kemokin benzeri reseptör 1)'in ana ligandıdır. Epitel hücreler, karaciğer, dalak, lenf düğümleri vb. dahil birçok dokuda mevcuttur. Bu şekilde, makrofajlar, plazmositoid dendritik hücreler ve NK hücreleri gibi CMKLR1 ifade eden lökosit popülasyonlarının enflamasyon bölgesine kemotaksisini başlatır. Plazmada her yerde, sürekli, nanomolar konsantrasyonlarda 143 aa prokemerin olarak bulunan protein, serin ve sistein proteazlarının yanı sıra karboksipeptidazlar tarafından proteolitik kesime uğrayarak, farklı formlar halinde aktive olur. Kemerin, ortamdaki uyarıcıya ve incelenen hastalığa göre, hem pro-enflamatuvar, hem de anti-enflamatuvar cevaplara sebep olabilmektedir. Eritematöz, romatoid artrit, psöriyazis (sedef hastalığı), Crohn hastalığı gibi enflamatuvar hastalıklarda, birçok kobay ve insan çalışmalarında da gözlemlendiği gibi, enflamasyon gelişiminde artan kemerin seviyelerinin hastalıklarla ilişkisi gösterilmiştir. CMKLR1 nakavt farelerde, EAE'de merkezi sinir sistemi (MSS) enflamasyonunun ve sigara içmeye bağlı kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) modelinde pulmoner enflamasyonun azaldığı gösterilmiştir. Bu şekilde, kemerinin pro-enflamatuvar rolü ortaya konmuştur. Fakat, LPS ile akciğer hasarlı modelde ve pro-enflamatuvar markerlerin ifadesi azaltılmış akut viral pönomi modelinde, CMKLR1 nakavt farelerde ve kemerinin baskılandığı durumlarda, kemerinin anti-enflamatuvar rolü de gözlemlenmiştir. Makrofajlar, dışarıdan gelen uyarılara adapte olmak için yerel enflamatuvar durumlarını şekillendirebilen, uyarana ve yerel mikroçevreye göre polarize olabilen, plastik ve heterojenik bir hücre grubudur. Makrofajlar, klasik yollardan aktive olan- M1 tipi-makrofajlara ve alternatif yollardan aktive olan –M2 tipi-makrofaj alt gruplarına polarize olabilmektedir. M1 tipi makrofajlar, granülosit makrofaj uyarıcı faktör (GM-CSF), lipopolisakkarit (LPS) ve IFN-γ tarafından üretilen doğal bağışıklık cevapta görülen, pro-enflamatuvar efektör hücrelerdir ve TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12/ IL-23 gibi pro-enflamatuvar sitokinler salgılarlar. M1 tipi makrofajların antimikrobiyal fonksiyonları, L-argininden nitrik oksit ve çok miktarda NO üreten, indüklenebilir niktik oksit sentazın (iNOS) ifadesinin artmasına bağlıdır. M2 tipi makrofajlar ise, IL-4/IL-13 veya M-CSF ile üretilen, immün baskılama ve doku tamirinde görev alan, IL-10 ve IL-1RA salgılayıp, düşük seviyelerde IL-12/ IL-23 ifade eden hücre gruplarıdır. Bu hücreler, NO üretmezler. M2 tipi makrofajlar, sitokin ifade profillerine göre kendi içlerinde M2a, M2b, ve M2c olmak üzere alt gruplara ayrılırlar. H. pylori'nin makrofajlardaki etkileri ile ilgili birkaç çalışma mevcuttur. İlk çalışmalarda, H. pylori'nin makrofajlarda IL-6, IL-8, TNF-α, IL-1-β gibi pro-enflamatuvar sitokinlerle birlikte indüklenebilir NO sentetaz (iNOS) enziminin ekspresyonunu indüklediği gösterilmiştir. H. pylori pozitif bireylerden alınan gastrik biyopsi örneklerinde alternatif olarak aktive olan M2 makrofajlar gözlenmiştir. Ayrıca, H. pylori enfeksiyonu durumunda insan monositleri, IL-1β, IL-6, IL-10 ve IL-12p40 (kısmen IL-23 olarak salgılanan) salgılarken IL-12p70 sitokini salgılamamıştır. Bununla beraber, doğal immün sistem hücreleri tarafından salgılanan sitokinler, makrofajların ve dendritik hücrelerin antijen sunması ve mikroçevredeki değişimler, H. pylori'ye karşı sonradan kazanılmış immün cevabı aktive eder. İnsanlarda H. pylori'ye karşı makrofaj aracılı pro-enflamatuvar Th1 ve Th17 immün cevap hakimdir. Kemerin/kemerin reseptör sinyalleşmesi, artan integrin kümelenmesi yoluyla (VLA-5 ve VLA-4) kemotaksise ve makrofajların hücre dışı matriks proteinlerine ve endotelyal hücrelere adhezyonuna aracılık eder. Farelerde kemerinin ChemR23-bağımlı anti-enflamatuvar ve koruyucu etkileri gözlenmiştir. İnsanlarda ise LPS, TNF-a and IFN-g uyarımı, kronik ve sistemik enflamasyonla ilişkili olan monositlerde ve makrofajlarda ChemR23 ekspresyonunu artırmıştır. Ayrıca, makrofajlar farklı kemerin izoformlarına cevap olarak pro- ve anti-enflamatuvar yanıt oluşturabilir. Kemerinin DSS ile indüklenen kolit modelinde in vivo and in vitro koşullarda artan pro-enflamatuvar sitokin profilinin yardımıyla M2 makrofaj polarizasyonunu baskıladığı gözlenmiştir. Bir başka çalışmada M1 makrofajlarda belirgin IL-10 ekspresyonu ile birlikte artan kemerin ekspresyonun gözlenmesi kemerinin M1 makrofajlardaki enflamatuvar etkisini açıklamaktadır. Belirgin kemerin ekspresyonunun, makrofaj öncüllerinin 10-24 haftalık fetal bağırsakta sürekli olarak toplanmasında görev alan ve yeni doğanlarda konak savunma mekanizmasını ve mukozal bağışıklığı artıran intestinal epitel hücreler (IECler) tarafından gerçekleştirildiği gösterilmiştir. Fakat, olgun IEC'lerin aksine sadece fetal IEC'ler kemerin üretir. Makrofajlarda H. pylori'nin etkilerini araştıran birçok çalışma değerli görüşler ortaya koymuştur. Ayrıca, kemerin ve makrofajlar arasındaki ilişkiyi araştıran çalışmalar da mevcuttur. Fakat, H. pylori ile indüklenen patogenezde kemerinin makrofaj polarizasyonuna etkisini araştıran çalışmalar henüz yoktur. H. pylori'nin insanda potansiyel olarak M1 ve M2 tipi makrofajları indükleyebildiği bilinirken; kemerinin bu ilişkiyi nasıl etkileyebildiği bilinmemektedir. Dolayısıyla bu çalışmada, kemerin ve H. pylori'nin monositik hücre hattı olan THP-1 hücreleri üzerindeki etki ve bu hücrelerin sitokin profillerine göre polarizasyon durumları arasındaki farklılıklar araştırılmıştır. Literatürden epiteliyal hücrelerin kemerin salgıladıkları bilinmektedir. Kemerinin gastrik patolojideki etkisini gözlemlemek için, ilk olarak 3 gastrik epiteliyal hücre hattında (KATO III, AGS ve MKN45) kemerin ekspresyonu araştırılmıştır. Klasik PCR sonuçları kemerinin bu hücreler tarafından eksprese edildiğini göstermiştir. Daha sonra, H. pylori'nin bu hücre hatlarında kemerin ekspresyonuna etkisi incelenmiştir. Bunu gerçekleştirmek için, KATO III, AGS ve MKN45 hücreleri yabani tip G27 suş sonikatı ve bu suşun ΔcagA mutant sonikatı ile olmak üzere 2 ayrı H. pylori sonikatı ile muamele edilmiştir. H. pylori virulans faktörü CagA'nın (sitotoksin-ilişkili gen-A) gastrik kötü huylu tümörlerle ilişkisi gösterildiğinden, bu çalışma için CagA virulans faktörü seçilmiştir. Kemerin ekspresyonu, KATO III and AGS hücre hatlarında yabani tip G27 ve ΔcagA mutant sonikatları ile 6 ve 24 saat muamele edildiğinde önemli ölçüde artmıştır. Bundan sonra ise kemerin ifadesi azalmıştır. Ancak MKN45 hücre hattında anlamlı bir ifade gözlenmemiştir. Bu nedenle diğer deneylere KATO III and AGS hücre hatları ile devam edilmiştir. Daha sonra, H. pylori muamelesi ile mRNA ekspresyonunun yanı sıra protein ifadesinin de artıp artmadığı kontrol edilmek istenmiştir. Tekrarlı western blot optimizasyon deneyleri sonucunda, herhangi bir hücre hattının muamele edilen ve edilmeyen gruplarında kemerin bandı görülmemiştir. Bu sonuçların nedeninin protenin olmaması veya antikorun proteine yetersiz bağlanması olduğunun kararlaştırılması amacıyla, insan kemerini klonlanmış ve HEK293T hücre hattına transfekte edilmiştir. Tüm örnekler kullanılarak western blot gerçekleştirilmiştir ve kemerin sadece insan kemerin genini içeren plasmid ile transfekte edilen HEK293T nin tüm hücre ekstraktında tespit edilmiştir. Sonuç olarak, H. pylori muamelesinden sonra kemerin artışı mRNA seviyesinde tespit edilirken, protein seviyesinde görülememiştir. Daha sonra, H. pylori pozitif akut gastrit ve kronik ülser hastalarında da kemerin ekspresyonunu incelenmiştir ve patoloji göstermeyen enfekte olmamış hastalarla karşılaştırılmıştır. Real-time PCR deneyler, ülser hastalarında kemerinin anlamlı ölçüde fazla bulunduğunu göstermiştir. Gastrit hastalarının numunelerinde, kemerin mRNA ifadesinin, kontrol grubuyla anlamlı farklılıklar göstermediğine dikkat edilmelidir. Bu veriler, akut gastrit ve kronik ülserli H. pylori pozitif hastaların ve H. pylori negatif sağlıklı bireylerin gastrik dokuları üzerinde yürütülen immünohistokimya analizlerinden elde edilen sonuçlar tarafından desteklenmektedir. Daha sonra, kemerinin makrofajların polarizasyon durumu üzerindeki etkilerini incelenmiştir. Bu amaçla, monositik bir hücre hattı olan THP-1 kullanılmış ve monositlerin makrofajlara farklılaşmasını indüklemek için PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) ile muamele edilmiştir. Farklılaşan makrofajların M1 and M2 alt tiplerine polarize olması için kemerin varlığında ve yokluğunda sırasıyla LPS ve rekombinant IL-4 gibi farklı uyaranlar eklenmiştir. Monositlerin makrofajlara farklılaştığını göstermek için makrofajlara özgü belirteçlerin varlığına bakılmıştır. Aynı zamanda, klasik PZR ile sitokin seviyeleri ölçülmüştür. IL-1β ve IL-6 pro-enflamatuvar sitokinleri M1 tipi makrofajların belirteci olarak kullanılmıştır. Her ikisinin de LPS ile muamele edilen örneklerde anlamlı ölçüde arttığı gözlemlenmiştir. Kemerin, LPS ile uygulandığı zaman, yalnızca ilk setteki LPS ile muamele edilen örnekler ile karşılaştırıldığında IL-1β'nın anlamlı ölçüde yüksek ekspresyonu ve IL-6'nın düşük ekspresyonu gözlenmiştir. Başlangıçta, kemerinin M1 tipi makrofajlara polarizasyonunda bir etkisinin olabileceği düşünülmüştür, ancak tekrarlanan üç deney sadece LPS ile veya kemerin ile muamele edilen örneklerde IL-1β ve IL6 ekspresyonunda bir değişim olmadığını göstermiştir. Bu da, kemerinin M1 tipi hücrelere polarizasyona bir etkisinin olma olasılığını ortadan kaldırmıştır. M2 polarizasyonunu tespit etmek için IL-10 ekspresyonu değerlendirilmiştir. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, IL-4 muamele edilen gruplarda IL-10'un ekspresyonu artış göstermiştir ve kemerinin IL-4 ile birlikte uygulanması bu etkiyi ortadan kaldırmıştır. Bu da, Lin vd. (2014) tarafından yapılan kemerinin M2 ile ilişkili genlerin ekspresyonunu azalttığı çalışmayı desteklemektedir. Sonuç olarak, yapılan çalışmada, H. pylori'nin makrofajlar üzerindeki etkisini değiştirip değiştirmediğini kontrol etmek için, kemerin varlığında ve yokluğunda, H. pylori'nin makrofaj polarizasyonu üzerideki etkisi incelenmiştir. THP-1 makrofajları kemerinin varlığı ve yokluğunda yabani tip G27 ve ΔcagA mutant sonikatları ile 24 saat muamele edilmiştir. Sonikat muamelesi makrofajları yüksek IL-1β ve IL6 üreten, pro-enflamatuvar profilindeki M1 alt tipine polarize ederken IL-10'u da arttırmıştır. M1 makrofajlarının bakteriyal uyarımına cevap olarak IL-10 ürettiği bilinmektedir, bu durum ayrıca laboratuvarımızdaki diğer bir çalışmada H. felis ile uyarılan bir fare modelinde de gözlenmiştir (yayımlanmamış veri). Ancak, H. pylori sonikatlar ile birlikte kemerin muamele edildiğinde IL-1β, IL6 ve IL-10 ekspresyonunda hiçbir değişiklik gözlenmemiştir. Bu nedenle, sonuçlarımız, H. pylori ile indüklenen M1 makrofaj polarizasyonunda kemerinin bir rolü olmayabileceğini önermektedir, ancak M2 polarizasyonunun kemerin muamelesi ile H. pylori'den bağımsız şekilde engellendiği gözlemlenmiştir.