Hibernasyonda Rana macrocnemis (amphibia : anura)' da DNA hasarının araştırılması

HİBERNASYONDA RANA MACROCNEMİS (AMPHİBİA : ANURA)' DA DNA HASARININ ARAŞTIRILMASI Deoksiribonükleik asit (DNA), yaşamsal hücresel işlevlerin sürdürülebilmesi için hayati öneme sahip olmakla birlikte, bir dizi endojen ve eksojen faktör tarafından hasara uğratılabilen hassas bir yapıdır. Metabolik yan ürünler olarak üretilen reaktif oksijen türleri (ROS), iyonize radyasyon, çevresel toksinler ve termal dalgalanmalar gibi genotoksik etkenler, iplikçik kırıkları, baz modifikasyonları ve diğer yapısal bozulmalar dahil olmak üzere bir dizi lezyona yol açabilir. Bu çalışmada, DNA hasarını nicel olarak değerlendirmek için Single Cell Gel Electrophoresis tekniği, yaygın olarak bilinen adıyla Comet Assay (Kuyruk Analizi) yöntemi kullanılmıştır. Yöntem, yüksek hassasiyeti, teknik uygulanabilirliği ve uygun maliyeti nedeniyle seçilmiştir. Çalışmada, anura türü Rana macrocnemis'e ait 15 bireyden periferik kan örnekleri alınmıştır. Sonrasında, örnekler mikroskop lamları üzerinde düşük erime noktalı agaroz içine gömülmüştür. Hücre zarları ve nükleer bileşenler, DNA'yı serbest bırakmak için standart bir alkali lizis tamponu kullanılarak çözündürülmüştür. Lizisi takiben, lamlar yüksek pH koşullarında elektroforeze tabi tutulmuştur. Bu işlem, negatif yüklü fragmente DNA'nın nükleer çekirdekten anota doğru göç etmesine ve karakteristik bir "kuyruk" oluşturmasına neden olur. Elde edilen nükleoidler floresan bir DNA-bağlayıcı boya ile boyanmış ve floresan mikroskobu altında görüntülenmiştir. DNA hasarı, dört standart parametre kullanılarak ölçülmüştür: Comet Uzunluğu (CL), Kuyruk Uzunluğu (TL), Kuyruktaki DNA Yüzdesi (%Tail DNA) ve hem kuyruk uzunluğunu hem de DNA'nın içindeki dağılımı entegre eden Zeytin Kuyruk Momenti (OTM). Fizyolojik ölçümlere tezat oluşturan şekilde, Comet Assay hibernasyonun belirgin bir stres etkisini ortaya koymuştur. Hibernasyon sonrası analiz, ölçülen tüm DNA hasarı parametrelerinde (CL, TL, %Tail DNA ve OTM) istatistiksel olarak oldukça anlamlı artışlar (p < 0.001) göstermiştir. Assayın geçerliliği, maksimum düzeyde DNA hasarı sergileyen pozitif kontrol grubu ile doğrulanmış ve böylece protokolün genotoksisiteyi tespit etmedeki etkinliği teyit edilmiştir. Çalışmada fizyolojik gözlemler ise, R. macrocnemis' te hibernasyon öncesi dönemle ilişkili fizyolojik değişiklikleri de belgelemiştir. Bireylerde belirgin bir davranışsal hareketsizlik, uzuvların vücuda yaklaştırılması ve bariz küresel bir vücut postürü gözlemlenmiştir. Hibernasyon öncesi ve sonrası morfometrik verilerin (vücut ağırlığı ve snout-vent uzunluğu) karşılaştırmalı analizi, bir azalma eğilimi göstermesine rağmen, bu farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p > 0.05). Elde edilen bulgular, R. macrocnemis'te hibernasyonun makro fizyolojik parametrelerde yalnızca minimal ve anlamsız değişikliklere yol açtığını, ancak önemli moleküler strese neden olarak kayda değer DNA fragmantasyonu ile sonuçlandığını göstermektedir. Bu genotoksik etkinin, muhtemelen metabolik baskılanma ve özellikle enerji açısından demanding olan uyanma (arousal) fazları sırasında reaktif oksijen türleri (ROS) üretimindeki eşzamanlı bir artışa atfedilebileceği düşünülmektedir. Bu sonuçlar, hibernasyonun sadece uyum sağlayıcı bir enerji koruma durumu olmadığını, aynı zamanda önemli bir oksidatif ve genotoksik zorlanma dönemini temsil ettiğini vurgulamaktadır. Çalışma, amfibilerde hibernasyon fizyolojisi ile moleküler stres biyo-belirteçleri arasındaki ilişkiyi aydınlatmakta ve Türkiye'nin yüksek rakımlı ekosistemlerinde yaşayan R. macrocnemis'in kışlama stratejileri ve hücresel altı duyarlılığı hakkında kritik bilgiler elde edilmiştir.