HPLC analizinde çakışan pik veren bileşiklerin DAD, on-line FRAP ve peroksinitritle reaksiyon kullanılarak ayırt edilmesi

Bu çalışmada, 16 fenolik asit standardı (rosmarinik asit, benzoik asit, p-OH benzoik asit, protokatekuik asit, protokatekualdehit, syringik asit, sinapik asit, p-kumarik asit, ferulik asit, kafeik asit, gentisik asit, vanilik asit, vanilin, gallik asit, syringaldehit, klorogenik asit) 25 °C'de, çözücü gradienti ve süre faktörleri değiştirilerek çakıştırıldılar. DAD ile çakışan bileşen analizleri yapıldıktan sonra fenolik asitlerin yerleri belirlendi. Aynı yerde pik veren fenolik asitlerin spektrum farklılıklarından ayırt edilmesi sağlandı. Çakışan pikler için farklı dalga boylarındaki absorbans oranlarına karşılık gelen yüzde bileşim grafikleri oluşturularak karışımdaki bileşimler bulundu. Fenolik asitlerin çakışma durumunda ayırdedilebilecekleri dalga boyları belirlendi ve standartların çakışmayacağı karışımlar hazırlandı, on-line FRAP'la 10 farklı konsantrasyonda antioksidan aktiviteler belirlendi. Klorogenik asit ? p-OH benzoik asit ve vanilik asit ? kafeik asit ikililerinin kalitatif ayrımı sadece klorogenik asit ve kafeik asitin aktif olması sayesinde 595 nm'de gerçekleşti. Vanilin ? p-kumarik asit ikilisinin herikisinin de aktivitesinin olmamasından dolayı bu yöntemle ayrımı gerçekleştirilemedi. Gentisik asit ? protokatekualdehit ve ferulik asit ? sinapik asit ikililerinde ise her iki bileşen de aktif olduğundan, 280 nm ve 595 nm'deki pik alanları oranlarından çizilen grafikler yardımıyla karışımdaki yüzde molar bileşimleri hesaplandı. Ayrıca standartlar, laboratuvarda sentezlenen peroksinitritle tek tek, off-line olarak hem pH 7.4'te hem de peroksinitritin 1 M HCl ile reaktivitesi durdurularak muamele edilip HPLC' de yürütüldüler ve fenolik asit pik kaybolması veya dönüşüme uğramasıyla da fenolik asitler ayırt edildiler.