Theses supervised by Prof. Dr. Murat Küçük
11 theses · Karadeniz Technical University
Bitki özütleri ve doğal ürünlerin tereyağının bozunmasını önleyici olarak kullanılmaları
Gıda teknolojisi açısından bakıldığında yağ ve yağ içeriği zengin ürünlerin oksidasyona uğrama olasılıkları oldukça fazladır. Oksidasyona uğrayan bu ürünlerin lezzet, renk, doku, koku ve besin değeri gibi karakteristik özellikleri bozulmaktadır. Antioksidanlar oksidatif ransidite ve oksipolimerizasyon sonucu oluşan bu bozunmaları önleyebilmektedirler. Tereyağı veya benzeri gıdalarda oksidasyonu önlemek adına BHT, BHA ve TBHQ başta olmak üzere birçok sentetik antioksidan kullanılmaktadır. Antioksidan olarak kullanılmakta olan bu kimyasalların sağlık açısından birçok zararlı etkisi bulunmaktadır. Hem bu zararlı etkileri giderip hem de oksidasyonu önleyebilmek adına bitki ve baharatlarda bulunan flavonoidler, fenolik asitler, vitaminler ve uçucu bileşikler gibi daha çok sekonder metabolit olan doğal antioksidanları kullanmak daha anlamlı olacaktır. Bu amaçla çalışmada tereyağının tadında, kokusunda ve renginde değişiklik yapmayacak 22 adet bitki temin edilip sulu ve su ile doyurulmuş etil asetatlı ekstraktları hazırlandı. Bu numunelere in vitro antioksidan aktivitelerinin belirlenmesi amacıyla FRAP, DPPH ve Folin antioksidan aktivite testleri uygulandı. Bu çalışmaların ışığında yüksek antioksidan aktiviteye sahip bitki ekstraktları (UKS11, UKS15, UKS18, UKS19, UKS20, UKE15, UKE18, UKE19, UKE20) tereyağında oksidasyon ve acılaşmayı önlemek adına kullanılmak üzere seçildi. Seçilen bu bitki ekstraktlarının konsantrasyonları 200 ppm olacak şekilde tereyağına ilave edildi. Ayrıca bu numunelere paralel olarak tereyağına 200 ppm konsantrasyonda standart antioksidanlar BHT ve Trolox katılarak örnekleri hazırlandı. Hazırlanan tereyağı numunelerinde oksidasyonu takip etmek amacıyla TBA, PV ve FFA analizleri uygulandı. Takip edilen analiz sonuçlarından UKS15, UKS18, UKS20 ve UKE20 başta olmak üzere bitki ekstraktlarının birçoğunun tereyağında oksidasyonu önlemek üzere doğal antioksidan olarak kullanılabileceği sonucuna varıldı.
Farklı çözücülerle hazırlanmış bitki özütlerindeki karbonik anhidraz (CA) inhibisyon seviyelerinin belirlenmesi; ca araştırmalarında yeni yaklaşımlar
Karbonik anhidraz (CA) metabolizma sonucu oluşan karbondioksitin (CO2) bikarbonat (HCO3-) ve hidrojen (H+) iyonuna dönüştürülerek ortamdan uzaklaştırılmasında hayati öneme sahip bir enzimdir. Bugün çok yaygın olan kanser, obezite, glokom, nörolojik bozukluklar, epilepsi gibi hastalıkların tedavisinde CA enziminin inhibitörleri ilaç etken maddesi olarak araştırılmakta veya kullanılmaktadır. Piyasada bulunan çoğu sentetik olan ilaçların yan etkileri fazla ve vücut sıvılarındaki çözünürlükleri düşüktür. Özellikle sentetik ilaçların yan etkilerinin ve biyouyumsuzluklarının fazla olması günümüzde bitkisel kaynaklı ilaçlara yönelimi artırmıştır. Bu tez çalışmasında bitki ekstraktlarının karbonik anhidraz inhibisyonları belirlendi. Bu amaçla karbonik anhidrazın aktivitesini belirlemek için kullanılan esteraz ve hidrataz aktivitesi kullanıldı. Hidrataz aktivitesi esterazdan farklı olarak enzimin fizyolojik aktivitesidir. Bu çalışma sırasında üç farklı çözücüde (su, asetonitril ve metanol) ekstre edilmiş numuneler kullanılarak denemeler yapıldı. Tüm bunlarla beraber çalışılan numunelerden en iyi sonuç alınan numune seçilerek HPLC ile kromatografik profilleri belirlendi. Çözücünün aktif bileşen ekstraksiyonundaki etkisi farklı çözücülerle elde edilen ekstraktların kromatogramları ve aktiviteleri karşılaştırılarak ortaya koyuldu. Bu çalışmanın yapılmasıyla ilaç etken maddesi olarak yeni CA inhibitörlerinin belirlenmesindeki önemli bir adım tamamlanmış oldu. Daha ileri yapılacak çalışmalarla birçok hastalığın tedavisi için yan etkileri daha az olan ya da hiç yan etkiye sahip olmayan vücutla biyouyumluluğu yüksek yeni ilaç hammaddeleri geliştirilebilecektir.
HPLC ile proteinlerin ayrılmasında dedeksiyon amaçlı yeni on-line yöntemin geliştirilmesi ve gıda ve ilaç analizinde uygulanması
Protein tayininde kullanılan mevcut UV-Vis spektrofotometrik yöntemlerin taraması yapıldıktan sonra, bu yöntemlerden üstün validasyon özelliklerine sahip olanların HPLC ile protein ayrılmasına uyarlanması sayesinde kolon sonrası reaktif enjeksiyonuyla kantitatif protein tayininin yapılabileceği on-line HPLC-Protein tayin sistemi (On-line HPLC-Biüret, On-line HPLC-Ninhidrin, On-line HPLC-Bradford) geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu yöntemlerden dedeksiyon açısından üstün olan On-line HPLC-Bradford yöntemi ile ayırım sonrası 595 nm'de kantitatif miktar belirleme mümkün olmuş, 280 nm'deki yarı kantitatif ölçüme göre daha güvenilir ölçümlere imkan sağlanmıştır. Bilinen çeşitli standart protein numunelerinin (CA ve BSA proteinleri) kullanılmasıyla on-line yöntemin optimize edilmesinden sonra tayin ve tespit sınırları belirlendi ve gıda (jelatin proteini) ve biyofarmasötik ilaç (insülin, immünglobulin G proteinleri) proteinlerinin boyut dışarılama kolonu ile kantitatif tayini gerçekleştirilmiştir. Ayrıca organik çözücü sistemlerinin (metanol, etanol, asetonitril) proteinler (CA, BSA, immünglobulin G, insülin) ve Bradford reaktifi ile birlikte on-line HPLC'de izokratik ya da gradient uygulamaları farklı kolon sistemleri için model teşkil etmesi amacıyla % kompozisyonları değiştirilerek spektrofotometrik analizleri yapılmıştır. 0.3 mL/dk akış hızı, 70 mg/L reaktif konsantrasyonu, 30 °C sıcaklık ve 2.5 m tubing uzunluğu optimum olarak belirlenmiştir. Ayrıca son karışımda suyun yanında % 10'a kadar organik çözücünün de kullanılabileceği gösterilmiştir.
Kuşburnu bitkisinin biyoaktif kompozisyonu
Organizmada, yaşamsal fonksiyonlar gerçekleşirken serbest radikaller oluşur. Serbestradikaller önemli maddelerdir, ancak oldukça yüksek reaktiviteye sahip olduklarından dolayıbiyomoleküllerle reaksiyona girerek onların yapıların bozulmasına ve hücrelere zarar veren toksiközellikli bileşiklerin oluşmasına neden olabilirler. Antioksidan maddeler serbest radikallerlereaksiyona girerek onların bu zararlı etkilerini giderebilirler.Bu çalışmada Gümüşhane ve Zonguldak yöresinden toplanan kuşburnu bitkilerinin sulu,metanollü ve etil asetatlı ekstraktlarının antioksidan aktivitesi incelendi. Bunun yanında bitkiözütlerinin antimikrobiyal aktivite özellikleri ve karbonik anhidraz (CA) enzimine karşıinhibisyon etkileri de araştırıldı. Sulu ve metanollü ekstraktların toplam fenolik madde içeriklerigallik asit ve kateşin eşdeğeri olarak, metanollü, sulu ve etil asetatlı numunelerin demir (III)indirgeme/ antioksidan kuvveti (FRAP) Trolox® standartı ile, metanollü, sulu ve etil asetatlınumunelerin DPPH radikali temizleme aktivitesi BHT ve Trolox® standartları ile, sulunumunelerin karbonik anhidraz enzimi inhibisyonu aktivitesi asetazolamid standartı ile,antimikrobiyal aktivite özellikleri ampisilin, sefazolin ve nistatin standart ilaçları ilekarşılaştırılarak incelendi.Yaprak ve dal kısımlarının sulu ekstraktlarının CA enzimi üzerine inhibisyon etkisigösterdikleri bulundu. Etil asetatlı ve metanollü numunelerin antimikrobiyal özelliğe sahipoldukları tespit edildi. Yaprak, dal ve çekirdek kısımlarının metanollü ekstraktlarının yüksekantioksidan aktiviteye sahip oldukları görülmüştür. Online-HPLC-FRAP yöntemiyle antioksidanözelliği offline-FRAP yöntemiyle uyumlu çıkmıştır.Çalışma sonucunda dal ve yaprak kısımlarının yüksek biyoaktivite gösterdiği görülmüş vekuşburnu bitkisinin bu kısımlarında aktiviteden sorumlu bileşiklerin araştırılması faydalı olacaktır.
HPLC analizinde çakışan pik veren bileşiklerin DAD, on-line FRAP ve peroksinitritle reaksiyon kullanılarak ayırt edilmesi
Bu çalışmada, 16 fenolik asit standardı (rosmarinik asit, benzoik asit, p-OH benzoik asit, protokatekuik asit, protokatekualdehit, syringik asit, sinapik asit, p-kumarik asit, ferulik asit, kafeik asit, gentisik asit, vanilik asit, vanilin, gallik asit, syringaldehit, klorogenik asit) 25 °C'de, çözücü gradienti ve süre faktörleri değiştirilerek çakıştırıldılar. DAD ile çakışan bileşen analizleri yapıldıktan sonra fenolik asitlerin yerleri belirlendi. Aynı yerde pik veren fenolik asitlerin spektrum farklılıklarından ayırt edilmesi sağlandı. Çakışan pikler için farklı dalga boylarındaki absorbans oranlarına karşılık gelen yüzde bileşim grafikleri oluşturularak karışımdaki bileşimler bulundu. Fenolik asitlerin çakışma durumunda ayırdedilebilecekleri dalga boyları belirlendi ve standartların çakışmayacağı karışımlar hazırlandı, on-line FRAP'la 10 farklı konsantrasyonda antioksidan aktiviteler belirlendi. Klorogenik asit ? p-OH benzoik asit ve vanilik asit ? kafeik asit ikililerinin kalitatif ayrımı sadece klorogenik asit ve kafeik asitin aktif olması sayesinde 595 nm'de gerçekleşti. Vanilin ? p-kumarik asit ikilisinin herikisinin de aktivitesinin olmamasından dolayı bu yöntemle ayrımı gerçekleştirilemedi. Gentisik asit ? protokatekualdehit ve ferulik asit ? sinapik asit ikililerinde ise her iki bileşen de aktif olduğundan, 280 nm ve 595 nm'deki pik alanları oranlarından çizilen grafikler yardımıyla karışımdaki yüzde molar bileşimleri hesaplandı. Ayrıca standartlar, laboratuvarda sentezlenen peroksinitritle tek tek, off-line olarak hem pH 7.4'te hem de peroksinitritin 1 M HCl ile reaktivitesi durdurularak muamele edilip HPLC' de yürütüldüler ve fenolik asit pik kaybolması veya dönüşüme uğramasıyla da fenolik asitler ayırt edildiler.
On-line HPLC-FRAP antioksidan aktivite tayin yönteminin geliştirilmesi ve bazı doğal ürünlere uygulanması
Çalışmada, literatürdeki on-line HPLC-antioksidan yöntemlerine bir yenisi (on-line HPLC-FRAP) eklenmiş ve yöntem bitki numunelerine uygulanmıştır. Yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğu bilinen bitki ekstraktlarının (bitkisel poşet çayların şekerli/şekersiz sulu, ormangüllerinin metanollü, yaylaçayının farklı çözücülerdeki ekstraktları) spektrofotometrik (off-line) yöntemlerle antioksidan aktiviteleri belirlenmiştir. Sonrasında geliştirdiğimiz on-line HPLC-FRAP antioksidan yönteminde gradient şartlar, gradient pompa ve şırınga pompanın akış hızları, FRAP ile reaksiyon sıcaklığı ve FRAP'ın bekleme süresi, kullanılan 15 standardın ve ekstraktlardaki antioksidan bileşiklerin ve aktivitelerinin eşzamanlı olarak belirlenmesi için uygun hale getirilmiştir. 6 standardın LOD ve LOQ değerlerinin 0,4-14,7 ppm aralığında olduğu belirlenmiştir. Yeni yöntemle bitki ekstraktlarının bileşenlerinin antioksidan aktiviteleri belirlenmiş, sonuçlar spektrofotometrik FRAP verileriyle karşılaştırılmıştır. Ayrıca aynı sistemde (on-line) -ABTS ve -DPPH denenmiş ve -FRAP verileriyle karşılaştırılmıştır. Geliştirilen yöntem tüm standartlar için 0-1000 ?M aralıkta lineerlik göstermiştir. On-line sistemde reaksiyonun gerçekleştiği sarmalda geçen 1,5 dakikalık sürenin yeterli olduğu yapılan kinetik çalışmayla belirlenmiştir. Bitki ekstraktları için belirlenen on-line ve off-line toplam aktivite sonuçları uyum göstermiştir (R2 = 0,89). On-line sistemde bileşenlerin tek tek aktivitelerinin toplanmasıyla elde edilen veriler, ekstraktlarda bir arada bulunan bileşiklerin antagonizm ya da sinerji gösterebileceğini ortaya koymuştur. Bitki çaylarının şekerli/şekersiz ekstraktları arasındaki aktivite değişiminin off-line ve on-line yöntemde benzer ve bitkiden bitkiye farklılık göstermekte olduğu tespit edilmiştir. Geliştirilen on-line HPLC-FRAP yöntemi literatürden adapte edilen DPPH ve ABTS yöntemlerine göre gürültü ve antioksidan cevap açılarından üstünlükler göstermiş, gıda ve bitki numunelerindeki bileşenlerin miktar ve antioksidan aktivitelerinin belirlenmesi için oldukça uygun olduğu görülmüştür.
On-line HPLC-karbonik anhidraz enzim tayin yöntemi geliştirilmesi ve protein karışımlarında uygulanması
Aktif proteinlerin karmaşık numunelerden saflaştırılıp ayrılması işlemi oldukça zahmetli ve zaman alan bir süreci içermektedir. Giderek yaygınlaşan on-line HPLC uygulamaları, doğal biyoaktif bileşenlerin tespiti için önemli avantajlar sunmaktadır. Bu çalışmada protein karışımlarında esteraz aktivitesi gösteren proteinlerin on-line olarak belirlenip eş zamanlı karbonik anhidraz enzim tayininin yapılabildiği on-line HPLC-CA enzim tayin yöntemi geliştirilmiştir. Geliştirilen yöntem, akış hızları, tampon çözelti seçimi, konsantrasyonu ve pH' sı, reaksiyon sıcaklığı, tübing boyu ve substrat konsantrasyonu parametreleri üzerinden optimize edilmiştir. pH' sı 8,2 olan 0,15 M fosfat tamponu 0,5 mL/dk akış hızı ile, 5 mM p-nitrofenil asetat 0,3 mL/dk akış hızı ile sisteme gönderilip 210 nm' de protein ayrımı, 400 nm' de esteraz aktivitesi tespitinin 25 °C sıcaklıkta ve 3 m tübing boyunda yapılmasıyla optimum çalışma şartlarına ulaşılmıştır. Optimize edilmiş on-line HPLC-CA enzim tayin yöntemi, doğrusallık, doğrusal aralık, tespit (LOD) sınırı, tayin (LOQ) sınırı, kesinlik ve sağlamlık parametreleri üzerinden valide edilmiştir. Yöntemin, 5 mg/mL BCA seviyelerine kadar doğrusal seyrettiği, LOD' un 0,03 mg/mL ve LOQ' un 0,07 mg/mL olduğu tespit edilmiştir. Tekrarlanabilirlik ve ara kesinlik bakımından %1 altındaki bağıl standart sapma yöntemin kesinliğini, akış hızı, reaksiyon sıcaklığı, hareketli fazın pH' sı ve konsantrasyonunda yapılan küçük değişiklikler sonucunda %5 altındaki bağıl hata ise yöntemin sağlamlığını göstermiştir. Yapılan çalışmalar, geliştirilen yöntemin protein içeriği bilinen ve bilinmeyen tüm çözeltilere rahatlıkla uygulanabileceğini ortaya koymuştur.
Bazı parametrelerin DPPH• Giderim Testine ve pH' nın biyoaktif bileşen ekstraksiyonu ve inkübasyonunda bileşim ve aktiviteye etkileri
Çalışmada DPPH•'nin kararlılığı, ortamın ışık, sıcaklık, çözücü ve pH şartları açısından 517 nm absorbansları ve UV-Vis spektrumları ile değerlendirildi. Çözücünün DPPH•' nin kararlılığını etkilediği, 10 - 20 ºC de bozunmanın yavaş, 30 - 40 ºC de yüksek olduğu görüldü. Spektrumlarda 470-620 nm arası absorbans değerlerinden türetilmiş absorbanslar üretilerek DPPH• bozunma süreçleri daha iyi gösterildi. Bu yöntem su ve pH 7'de DPPH•'nin daha kararlı, 20 – 30 ºC aralığında bozunmada ciddi artış olduğunu gösterdi. Bekleme sürecinde absorbans farklarıyla elde edilen spektrumlarda, 510-520 nm bölgesinde önemli düşüşler, 390-400 nm bölgesinde ise önemli artışlar tespit edildi. Fark grafikleri su ve pH 7'de düşük sıcaklıklarda DPPH•'nin daha kararlı olduğunu gösterdi. Antioksidan-DPPH• etkileşimine çözücü, tampon konsantrasyonu ve ortam pH'sının etkisi araştırıldı. Beş antioksidan (gallik asit, Troloks, BHT, kateşin, C vitamini), beş çözücü (metanol, su, DMSO, aseton, etil asetat) ve üç pH (2, 7, 10) ile yapılan çalışmalar, çözücü, tampon konsantrasyonu ve pH farklılıklarının, aktivitede artışa veya azalmaya sebep olabileceğini gösterdi. Ekstraksiyonda ve depolamada antioksidanların kararlılığının tespiti için standart antioksidanlar ve yeşil çay ekstraktları klasik DPPH•, FRAP, toplam fenolik miktarı ve karbonik anhidraz inhibisyonu ve on-line HPLC-DAD-FRAP antioksidan yöntemiyle incelendi. pH'nın bileşen kararlılığını ve biyoaktiviteyi etkilediği, etkinin bileşik bazlı olarak farklılık gösterdiği, ektraktlarda pH 2'de yüksek, pH 10'da düşük aktiviteyle sonuçlandığı gözlendi. DPPH• çalışmalarında reaktif ve numune tazeliği, ışık, sıcaklık, pH, tampon konsantrasyonu ve çözücü aktiviteyi etkilemektedir. Numuneler arası aktivite kıyaslaması ancak aynı şartlarda elde edilen sonuçlarla yapılabilir.
Substrat kullanarak yeni bir antioksidan yöntem geliştirilmesi ve uygulanması
İlaç bileşenleri, gıda bileşenleri ve birçok endüstriyel ürün oksidasyona maruz kalmakta ve bu nedenle de stabilite için normal ortamda antioksidanlara ihtiyaç duymaktadır. Dolayısıyla oksidasyon substratı olarak böyle bileşenlerin kullanılmasıyla onları koruyacak antioksidanların tespitine dönük yeni yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu amaçla bu tez çalışmasında DPPH radikal temizleme, ABTS radikal temizleme ve Peroksinitrit temizleme yöntemleri üzerinde çalışılarak ve çeşitli substratlar denenerek yeni bir tayin yöntemi geliştirilmiştir. Bu üç yöntem ve potansiyel substratlar hem klasik spektrofotometrik olarak hem on-line HPLC-kolon sonrası antioksidan aktivite ölçümü kullanılarak, hem de reaksiyon sonrası HPLC ile antioksidan korumanın ölçüldüğü uygulama şeklinde denenmiş, çok sayıda ön çalışma sonrasında uygulanabilirliği olan ve yaygın uygulanma potansiyeli en yüksek olan reaksiyon sonrası HPLC ile antioksidan korumanın ölçüldüğü ve model substrat olarak ta Kateşin'in ve Troloks'un kullanıldığı uygulama yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntem ile ilgili optimizasyon ve validasyon çalışmaları yapılmış, geliştirilmiş yöntem standart antioksidanlar (Gallik asit, BHT, Kafeik Asit ve Askorbik Asit) ve gerçek numune olarak kına ekstresi üzerinde uygulanmıştır. Bu tez çalışmasında geliştirilen yeni substrat bazlı DPPH radikaline karşı koruma aktivitesi yöntemi daha sonraki çalışmalara öncülük edecek nitelikte olup literatüre bu yaklaşımla DPPH anti radikal aktivite yöntemi kazandırmıştır. Anahtar Sözcükler: Antioksidan aktivite, DPPH, HPLC, Kına, Substrat
Yeni bir kolorimetrik kan kalsiyum ölçüm yönteminin geliştirilmesi ve uygulanması
A new approach for measuring calcium in serum using colorimetry is introduced, which utilizes the o-Cresol Phthalein Complexone (CPC) method. This method replaces traditional ultraviolet-visible (UV-Vis) spectrometry with a more straightforward and cost-effective smartphone-based digital image colorimetric technique. The optimal conditions determined for this method include using the green color model as the most effective, maintaining a distance of 25 cm between the detection camera and the sample solution, and positioning the light source 3 cm from the sample solutions. Under the optimum conditions, the coefficient of determination was 0.9917 within a linear dynamic range up to 20 mg /dL. The precision of the method based on the percent relative standard deviation was below 5%. The detection limit (LOD) and quantitation limit (LOQ) were determined to be 0.46 mg/dL and 1.56 mg/dL, respectively, which are adequate for measuring calcium levels in serum. The method's accuracy was confirmed through validation with an independent experiment using a UV-Vis method. The two methods demonstrated strong statistical agreement, underscoring the reliability of the proposed approach.
Kamera ile yeni bir kolorimetrik üreaz aktivite tayin yönteminin geliştirilmesi ve uygulanması
Sentetik ve doğal bileşiklerin ve karışımların biyoaktivitelerinin ölçülmesinde kullanılan yöntemler, onların çeşitli amaçlarla kullanılabilirliğinin araştırılmasında önemli araçlardır. Günümüzde antioksidan ve enzim inhibisyonu gibi birçok biyoaktivitenin belirlenmesinde yeni yaklaşımlarla yöntemler geliştirilmiş ve uygulanmaktadır. Spektrofotometrik ölçüm yöntemlerini pratikleştirmek amacıyla spektrofotometre cihazı ihtiyaç olmadan yeni kolorimetrik yaklaşımlar geliştirilmekte ve uygulanmaktadır. Bu doktora tezinde de literatürde var olan fenol kırmızısı kullanımı yaklaşımına dayalı yeni bir kolorimetrik üreaz aktivite tayin yöntemi geliştirilmiş, validasyonu ve inhibisyon ölçümü amacıyla doğal ve sentetik numunelere uygulanması gerçekleştirilmiştir. Geliştirilen yöntem mikroplaka, ışık parlaklığı, sıcaklık, mikroplaka-kamera arası mesafe gibi parametreler açısından optimize edilmiş, yöntemin validasyonu yapılmıştır. Valide edilmiş yöntemde ideal ortam ve şartları 25oC'de kutu içerisinde, ışık kaynağı 0 cm'de ve parlaklığı %60, mikroplaka-kamera uzaklığı 25 cm ve düz dipli mikroplaka kullanılması olarak belirlenmiştir. Geliştirilen yeni kolorimetrik yöntemle yeşil çay ekstraktı ve 2 adet sentetik bileşiğin %inhibisyon değerleri spektrofotometrik yöntemle kıyaslamalı olarak başarılı bir şekilde belirlenmiştir.