Hücre ölüm yolaklarının tespiti için kağıt tabanlı biyosensör tasarımı

Sunulan tez kapsamında, apoptozun erken (ekstrinsik yolak) ve geç (instrinsik yolak) safhasının tespitinde kullanılmak üzere kağıt tabanlı biyosensör tasarımı gerçekleştirilmiştir. Çalışmada geleneksel apoptoz tayin yöntemlerinin yüksek maliyet, büyük hacimlerdeki örneklem gereksinimi, uygun laboratuvar ve ekipman koşulları gibi dezavantajları bertaraf etmek için daha ucuz, kolay, düşük hacimlerde örneklem kullanımı sağlayan ve daha hassas kantitatif sonuçlar veren kağıt tabanlı bir sistem geliştirilmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında; ilk olarak örneklem ile etkileştirilecek manyetik nanopartiküllerin sentezi ve primer kaspaz antikorlarının bu nanopartiküllerin yüzeyine immobilize edilmesi gerçekleştirilmiş ve taramalı elektron mikroskobu (SEM), Zeta potansiyel ve boyut ölçümü, Fourier dönüşümlü infrared spektroskopisi (FTIR), Termogravimetrik Analiz (TGA), Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) ile karakterize edilmiştir. Primer antikor immobilize manyetik nanopartiküllerin standart kaspaz proteinleriyle oluşturduğu kompleksin optimizasyonu ve seçicilik çalışmaları HPLC sistemi ile incelenmiştir. Optimizasyon çalışmaları kapsamında pH: 7.4'te protein konsantrasyonları (11,2-0,7 mg/mL), optimal süre (5-90 dk), sıcaklık (4-42°C) parametreleri incelenmiştir. Optimal koşullar pH: 7.4, konsantrasyon; 5,6 μg/mL, süre: 45 dk ve sıcaklık: oda sıcaklığı olarak belirlenmiştir. Seçicilik çalışmaları kapsamında ise yarışmacı proteinlerin ( Kaspaz-3, Kaspaz-8, Kaspaz-9 ve lizozim) adsorbsiyonu araştırımıştır. Aynı yarışmacı proteinler kontrol grubu olarak antikor immobilize edilmeyen manyetik nanopartiküllerle de etkileştirilmiştir. Daha sonra toplama bölgesine immobilize edilecek upconversion silika nanopartiküllerin sentezi ve bu partiküllere sekonder antikorun immobilizasyonu gerçekleştirilmiş ve taramalı elektron mikroskobu (SEM), Zeta potansiyel ve boyut ölçümü, Fourier dönüşümlü infrared spektroskopisi (FTIR), Termogravimetrik Analiz (TGA), Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) ile karakterize edilmiştir. Ardından primer antikor immobilize edilmiş manyetik nanopartiküllerle optimal koşullarda muamele edilmiş standart kaspaz proteinlerinin, sekonder antikor immobilize edilmiş upconversion silika nanopartiküllerle dispersiyon ortamında oluşturduğu suprakompleksin zeta potansiyel ve boyut ölçümü ve florasan emisyon spektrometresi analizi gerçekleştirilmiştir. Bu analizlerin sonucunda dispersiyon ortamında oluşan sandviç ELISA modelinin upconversion özelliğini koruduğu ve yapıya katılan protein miktarının artmasıyla bu özellikten kaynaklı emisyon yoğunluklarında düşüş olduğu gözlenmiştir. Bu da kantitatif bir sonuç elde edilebilmesini sağlamıştır. Çalışmanın ikinci aşamasında hücre deneyleri gerçekleştirilmiştir. Bu kapsamda 100 μM Cisplatin ile muamele edilen ve edilmeyen MCF-7 meme kanseri hücre hattı kullanılmış ve bu hücrelerin lizatından elde edilen proteinler tasarlanan sistem ile dispersiyon ortamında analiz edilerek kaspaz protein miktarları saptanmıştır. Elde edilen sonuçlar geleneksel apoptoz tayin yöntemleri ile (İkili boyama, Annexin-v, MTT) karşılaştırılmıştır. Çalışmanın üçüncü aşamasında ise kağıt tabanlı sistem tasarlanmıştır. Bu amaçla, kullanılacak olan kağıt boyutu, üzerinde toplama bölgesine immobilize edilecek sekonder antikor immobilize upconversion slika nanopartikül hacmi (2,5-12,5 μL) ve örnek bölgesinden uzaklığı, örnek bölgesine damlatılacak primer antikor immobilize manyerik nanopartiküllerin hacmi (10-100μL) belirlenmiştir. Ardından dispersiyon ortamında standart kaspaz proteinlerle ve hücre lizatlarıyla gerçekleştirilen çalışmalar kağıt üzerinde incelenmiştir. Dispersiyon ortamından elde edilen sonuçlar ile kağıt üzerinde gerçekleştirilerek elde edilen sonuçlar karşılaştırılarak validasyon yapılmıştır. Tüm bu çalışmaların sonucunda tasarlanan kağıt tabanlı sistem ile geleneksel yöntemlerden daha hassas ve güvenilir sonuçlar elde edilebileceği gösterilmiştir.