Hücre tabakası mühendisliğinde kalınlık ve vaskülerizasyon problemlerine yönelik stratejilerin geliştirilmesi

Doku mühendisliği çalışmaları kapsamında bugüne kadar çeşitli dokuları onarmak ve yenilemek amaçlı çeşitli biyomalzemeler, hücreler ve biyosinyal molekülleri tek başlarına veya birlikte kullanılarak doku mühendisliği ürünü yapıların eldesine odaklanılmıştır. Hücresel terapilerle başlayan doku mühendisliği yolculuğu doku iskelesi temelli yaklaşımlarla büyük bir yol kat etmiş ancak hazırlanan bu üç boyutlu dokularda, hücre canlılığı için temel gereksinim olan çeşitli gaz ve besin maddelerinin taşınımı ve metabolik atıkların uzaklaştırılması sağlanamamıştır. Araştırmacılar bu bağlamda çeşitli biyoreaktörlerin tasarımı ve üç boyutlu biyofabrikasyon yöntemleri ile difüzyon sınırlamalarını ortadan kaldıracak tasarımlara yönelmiş ve elde edilen yapılarda çeşitli teknikler ile kütle aktarımını sağlayacak vasküler ağ yapısını oluşturmayı hedeflemişlerdir. Sunulan bu tez çalışması kapsamında da çeşitli doku hasarlarında kullanılmak üzere üç boyutlu biyofabrikasyon yöntemlerinden biri olan hücre tabaka mühendisliği ile çok katmanlı doku eşleniklerinin üretilmesi ve vaskülerize edilmesi amaçlanmıştır. Öncelikle MC3T3-E1 fare osteoblast öncülü hücreler, büyüme ortamı ve osteojenik ortam varlığında sıcaklık duyarlı kültür kaplarında (Nunc Upcell) ayrı ayrı kültürlenmiş ve hücre tabakası oluşturma potansiyelleri incelenmiştir. Bu aşamada MC3T3-E1 hücrelerinden oluşan sağlam, başka bir yüzeye transfer edilebilir ve pratik olarak elde edilebilir bir hücre tabakası eldesi literatürde ilk defa önerilmiştir. Hücre tabakaları eldesi sürecinde mikroskobik ve makroskobik görüntüleme, kollajen ve sülfatlanmış glikozaminoglikan (sGAG) miktarı tayini, osteojenik genlerin ifade düzeylerinin belirlenmesi, Alizarin Kırmızısı ile mineralizasyon sürecinin incelenmesi ve kalsiyum miktarı tayini çalışmaları yürütülmüş ve elde edilen bulgularla osteojenik ortamın üstünlüğü ortaya konulmuştur. Tez çalışmasının bir sonraki aşamasında osteojenik ortam uygulaması ile elde edilen hücre tabakaları üst üste lamine edilerek doku kalınlıkları artırılmaya çalışılmıştır. Bu aşamada, doku kalınlığını artırmaya yönelik ayrı bir yöntem olarak yine tez çalışması kapsamında üretilmiş, elektroeğirilmiş poli(L-laktik asit) (PLLA) membranlar kullanılmış ve nihai yapıların elde edilme süreci mikroskobik ve makroskobik bulgularla aydınlatılmıştır. Ardından PLLA membran kullanılarak elde edilen ve doğrudan hücre tabakalarının üst üste lamine edilmesiyle elde edilmiş çok katmanlı hücre tabakalarının in vitro etkinlikleri araştırılmıştır. Bu bağlamda, elde edilen nihai yapılarda öncelikle hücre canlılıkları ve hücre ölümü mikroskobik ve kolorimetrik yöntemlerle araştırılmıştır. Ardından, bir PLLA membranın üzerine iki hücre tabakasının lamine edilmesiyle oluşturulan ve toplam 3 PLLA membran ve 4 hücre tabakası içeren çok katmanlı yapıların kültür süresince sergilediği üstün sağ kalım ortaya konulmuştur. Böylece sunulan bu tez çalışması kapsamında doku mühendisliği ürünü, hücre-biyomalzeme kombinasyonunun sağlandığı, çok katmanlı, ıslak hali yaklaşık 1 mm olan, pratik bir şekilde transfer edilebilen, hücrece zengin ve hücrelerin kendi ECM'ini beraberinde taşıdığı üç boyutlu doku eşleniği yapılar üretilmiştir. Elde edilen bu yapılarda ayrıca kültür süresince alkalen fosfataz aktivitesi, kollajen, sGAG sentezine ilişkin karakterizasyonlar gerçekleştirilmiştir. Tez çalışmasının son kısmında ise bir önceki aşamada elde edilen nihai yapılarda ilerleyen süreçlerde vasküler ağ oluşumunu teşvik edecek endotel hücresi kültürü çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla yine bu tez çalışması kapsamında yüzeyi kanal ile desenlenmiş poli(gliserol sebakat) PGS elastomerler geliştirilmiş, karakterize edilmiş ve endotel hücresi kültürasyonu için ideal kültür şartlarının belirlenmesine yönelik çalışmalar gerçekleştirilmiştir. PGS elastomerlerinin kanallarında 14 gün süreyle endotelyal besi ortamı (EGM-2) ile kültüre edilen HUVEC hücrelerinin poligon biçiminde tübüler organizasyon sergilediği gözlemlenmiş ve anjiyogenezis sürecinin başladığı düşünülmüştür. Tez çalışması kapsamında geliştirilen yaklaşımların kraniyofasiyal kemik doku rejenerasyonu için kullanılabilirliği önerilmiş ve ileride osteokondral, kornea veya damar gibi ikili veya daha fazla mikroçevre içeren doku mühendisliği uygulamaları için de potansiyel teşkil edebileceği düşünülmüştür. Anahtar Kelimeler: Hücre Tabaka Mühendisliği, Çok Katmanlı Doku Eşlenikleri, Doku Kalınlığı Limitasyonu, Vaskülerizasyon.