Anti-apoptotik BAG-1M izoformunun etkileşim partnerlerinin meme kanseri ve meme epitel hücrelerinde tanımlanması

BAG-1 (Bcl-2 ilişkili athanogen-1) bir çok organizmada evrimsel süreçte korunmuş olan BAG ailesine ait anti-apoptotik bir proteindir. Hücre içerisinde önemli mekanizmada görev alan BAG-1, çok fonksiyonlu adaptör protein olarak bilinir. HSP70/HSC70 ısı şoku proteinleri, E3 ubikuitin protein ligazlar, nükleer hormon reseptörleri, Raf-1 serin/treonin kinaz ailesi ve Bcl-2 proteini gibi çeşitli moleküllerle olan etkileşimler ile BAG-1 transkripsiyon, hormon aktivitesi, hücre büyümesi, hücre hareketliliği ve proliferasyonu, tümörigenez, apoptoz mekanizması ve hücre içindeki önemli sinyal yolaklarını düzenlemektedir. BAG-1'in hücrenin yaşamını sürdürmesini sağlamakta olduğu düşünülmektedir. Yapılan çalışmalar meme kanseri, kolon kanseri ve prostat kanseri başta olmak üzere çeşitli kanser türlerinde BAG-1'in yüksek oranda ifade edildiğini göstermektedir. Hücre içerisindeki fonksiyonları göz önünde bulundurulduğu zaman BAG-1'in özellikle meme kanserinin oluşum ve gelişim sürecinde BAG-1'in önemli rolü olduğu düşünülmektedir. BAG-1 proteini aynı mRNA üzerindeki farklı başlangıç bölgelerinden translasyon sonucu oluşan üç ana izoformdan oluşmaktadır. BAG-1'ın üç izoformu da C-ucunda BAG domaini ve ubikuitin benzer domaini bulundurmaktadır. İzoformlar arasındaki fark N-ucu bölgesinden kaynaklanmaktadır. En büyük izoform olan BAG-1L, N-ucunda nükleer lokalizasyon sinyaline sahiptir ve nükleusta bulunur. BAG-1S hücre içerisinde en baskın olarak bulunan ve sitoplazmada lokalize olmuş en küçük BAG-1 izoformudur. BAG-1M ise ekspresyon seviyesi BAG-1L ve BAG-1S'ye kıyasla daha az olan ve nükleer lokalizasyon sinyali bulunmamasına karşın çeşitli aracı proteinler ile hem sitoplazma hem de nükleusta lokalize olabilen BAG-1 izoformudur. İzoformların bulundukları doku ve hücreye göre özelleşebildiği bilinmekte ancak izoform spesifik çalışmalar ile her bir BAG-1 izoformun etkileştiği proteinler ve görev aldığı mekanizmalar ile ilgili detaylı bilgi bulunmamaktadır. BAG-1M'nin hem sitoplazma hem de çekirdekte bulunabilmesi, bu izoformun hem DNA hem de sitoplazmik proteinler ile etkileşerek kanser sürecinde görev alabileceğini düşündürmüştür. Bu çalışmada BAG-1M izoformunun öncelikle BAG-1'in bilinen etkileşim partnerleri ile olan etkileşiminin incelenmesi ve hücre sağkalımı üzerindeki etkisinin gösterilmesi, sonrasında ise etkileşim partnerlerinin meme kanseri ve meme epitel hücrelerinde tespit edilmesi amaçlanmıştır. Yapılan bu çalışmanın BAG-1M'nin kanserli ve meme epitel hücrelerindeki farklı etkileşimleri göstererek bu izoformun meme kanseri oluşum ve gelişim sürecindeki rolünün aydınlatılmasına katkıda bulunması hedeflenmiştir. BAG-1M'nin etkileşim partnerlerinin tespit edilebilmesi için öncelikle N-ucu TAP etiketi içeren BAG-1M dizisini içeren vektör plazmid hücrelere transfekte edilmiş, ardından TAP etiketi pürifikasyonu ile transfekte edilen hücrelerden elde edilen total protein içerisinden BAG-1M saflaştırılmıştır. xxiv BAG-1M'nin hücre sağkalımındaki etkisi transfekte edilmemiş hücrelerle karşılaştırmalı olarak gösterilmiş, BAG-1M izoformunun yüksek ifadesinin hücre proliferasyonunu ve hücrelerin koloni oluşturma yatkınlığını arttırdığı hücre canlılığı testleri ile gösterilmiştir. BAG-1'in bilinen etkileşim partnerleri olan HSP-70, Bcl-2, Raf-1, Akt, Raf-1 ve Akt'ın sırasi ile 338. ve 473'üncü serinlerinden fosforillenmiş formları ile BAG-1M etkileşiminin olduğu saflaştırılan BAG-1M örneklerinde immün blotlama ile gösterilmiştir. Bilinen etkileşim partnerleri dışındaki etkileşen proteinlerin tespit edilmesi amacıyla saflaştırılan BAG-1M proteini tripsin ile peptitlerine parçalanmış ve peptit haritalama yöntemi için sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile analiz edilmiştir. Tespit edilen peptitler PLGS (Protein Lynx Global Server) kullanılarak UNIPROT veritabanı ile eşleştirilerek kimliklendirilmiş, iki biyolojik tekrarın ikişer teknik tekrarı yapılarak ortak bulunan proteinler BAG-1M etkileşim partnerleri olarak kabul edilmiştir. Sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi analizleri sonucunda tespit edilen BAG-1M etkileşim partnerlerinin hücre içerisinde dahil oldukları mekanizmalar ve protein-protein etkişim ağları sırası ile KEGG ve STRING internet ağ sunucuları kullanılarak analiz edilmiş, proteinler GO Enrichment analizi kullanılarak moleküler fonksiyonlarına göre karbon metabolizması, hücre iskeleti organizasyonu, stres yanıtı ve endoplazmik retikulumdaki protein işlenmesi olmak üzere dört kategori altında incelenmiştir. BAG-1'in endoplazmik retikulum ilişkili degradasyonda görev alabileceğinin düşünülmesinden dolayı bu çalışmada endoplazmik retikulumda protein işlenmesi kategorisine odaklanılmış, etkileşimlerin kanserli ve epitel meme hücreleri arasındaki farkları incelenmiştir. LC-MS/MS analizleri sonucunda kimliklendirilen proteinlerin doğrulanması amacı ile iki boyutlu jel elektroforezi (2-DE) yöntemi kullanılarak proteinler izoelektrik noktaları ve moleküler ağırlıklarına göre ayrılmış, jelden kesilen protein spotları MALDI-TOF analizleri ile kimliklendirilmiştir. Kütle spektrometresi ve iki boyutlu jel elektroforezi sonuçlarında ortak gelen proteinlerin BAG-1M izoformu ile etkileşimi meme kanseri ve meme epitel hücrelerinden saflaştırılan örneklerin immün blotlama analizleri ile de doğrulanmıştır. BAG-1M izoformunun etkileştiği proteinlerle oluşturduğu komplekslerin görev aldığı hücresel mekanizmaları aydınlatması amacıyla doğal formları korunarak transfekte edilen hücrelerden izole edilen ve saflaştırılan proteinlerin oluşturduğu kompleksler mavi poliakrilamid jel elektroforezi ile moleküler ağırlıklarına göre ayrılmıştır. Her bir kompleksin jelden kesilmesi, peptitlerine parçalanması ve LC-MS/MS peptit haritalaması ile kompleksteki proteinler tespit edilmiştir. Komplekslerin incelenmesi ile tespit edilen proteinlerin proteazom alt birimlerini, ubikuitinasyonda görev alan proteinleri, endoplazmik retikulumda yerleşik olan proteinleri içerdiği görülmüş, bu proteinlerin aynı komplekslerde bulunması da BAG-1M'nin endoplazmik retikulum ilişkili degradasyonda görev alabileceği düşüncesini desteklemiştir. Bu çalışmada yapılmış olan tüm deneysel çalışmalarda elde edilen sonuçlar, ısı şok proteini 90 (HSP-90), ısı şoku proteini 70 ailesi üyesi BiP (HSPA5), protein disülfid izomeraz A3 (PDIA3), geçişli endoplazmik retikulum ATPaz (VCP) ve UV eksizyon tamir proteini RAD23 homoloğu (RAD23B) gibi katlanma/yeniden katlanma mekanizmasında görevli ve ubikuitin ile ilişkili proteazomal bozunmada işlevi olan proteinlerle BAG-1M izoformunun etkileştiğini göstermiştir. Meme kanseri ve meme xxv epitel hücrelerinde BAG-1M ile VCP ve BAG-1M ile RAD23B etkileşimlerinin farklılık gösterdiği immün blotlama yöntemi ile gösterilmiştir. BAG-1M izoformunun VCP ve RAD23B ile kurduğu etkileşimin sadece meme kanseri hücrelerinde görülmesi bu etkileşimlerin kanser sürecinde önemli rolü olabileceğini düşündümüştür. Yeni tespit edilen etkileşim partnerlerinin PDB veritabanında bulunan yapıları BAG-1'in BAG domaini ve ubikitin benzeri domaini ile PRIŞM web sunucusu kullanılarak incelenmiş, kurulabilecek olası kompleksler yapıları ve iki protein arasındaki enerji seviyesine göre değerlendirilmiştir. Yapısal analizler, RAD23B, VCP ve PDIA3'ün BAG-1 ile etkileşime geçebileceklerini, ancak HSP-90 ve BiP ile BAG-1 etkileşiminin BAG-1'in her iki domaininden de pek olası bulunmadığını göstermiştir. Mavi-nativ jel elektroforezi ile kimliklendirilen kompleksler incelendiğinde, HSP-70 ile HSP-90 ve BiP'in bilinen etkileşimleri, BAG-1 ile HSP70 etkileşiminin biliniyor olması ve yapısal analizlerde BAG-1M ile HSP-90 ve BAG-1M ile BiP'in etkileşiminin olası bulunmaması, bu iki protein ile BAG-1M'nin birlikteliğine HSP-70 veya başka aracı proteinlerin sebebiyet verebileceğini düşündürmüştür. Bu çalışma ile BAG-1M izoformunun doğrudan (fiziksel) veya dolaylı (fonksiyonel) olarak etkileştiği proteinler kimliklendirilmiştir. BAG-1'in rol aldığı mekanizmalar, bilinen etkileşim partnerleri ve yeni tanımlanan etkileşen proteinler göz önünde bulundurulduğunda, endoplazmik retikulumdaki yerleşik proteinlerle, ubikuitinasyon mekanizmasında görev alan proteinlerle, proteazom alt üniteleri ve şaperonlarla olan etkileşimleri BAG-1M izoformunun endoplazmik retikulum ilişkili degradasyon (ERAD) mekanizmasında fonksiyonu olabileceğini önerisini desteklemektedir. Elde edilen deneysel bulgular ve gerçekleştirilen yapısal analizler ışığında gelecekte yapılacak olan bölgesel yönlendirilmiş mutasyonlar ile tespit edilen protein etkileşimlerinin bozulmasının hücre üzerindeki etkilerinin incelenmesi, degradasyon mekanizmasında hedef alınan substratların fonksiyonel analizler ile tespit edilmesi ve in vitro yüzey analizi çalışmaları ile etkileşimlerin analiz edilmesi gibi daha detaylı çalışmaların meme kanserinde bir biyobelirteç olarak görülen BAG-1'in BAG-1M izoformuna özgü fonksiyonlarının aydınlatılmasına, yeni tespit edilen etkileşimlerin kristal yapı çalışmalarına ve kanser tedavisinde kullanılabilecek küçük molekül sentezlenmesi ile yeni terapötik ajanlar geliştirilmesine katkıda bulunabileceği düşünülmektedir.