Septin3 ve p60-katanin (KATNA1) proteinlerinin etkileşiminin aydınlatılması

p60-katanin, katanin proteininin küçük alt birimi olup üzerinde çok çalışılan, bölünebilen hücrelerde mitoz sırasında mikrotubul dinamiğini etkileyen ve nöronlarda özellikle nöronal dallanma oluşumu açısından önemli bir proteindir. C-ucunda bulunan AAA bölgesi proteine ATPaz özelliği kazandırmakta, dolayısıyla p60-katanin mikrotubulleri kesmek suretiyle büyük parçalardan küçük mikrotubul parçaları oluşumunu sağlamaktadır. Mikrotubullerin bu şekilde kesilmesi hem bölünen hücrelerde hem de bölünmeyen hücrelerde yani nöronlarda akson ve dendrit gibi proseslerin dallanmalarında önemli rol oynamaktadır. Üzerinde çok çalışılan önemli bir protein olmasına rağmen p60-katanin'in hangi proteinlerce bu görevi düzenlendiği tam olarak aydınlatılamamıştır. p60-katanin'in bilinen regülatörlerinden birisi katanin'in diğer alt birimi olan p80-katanin'dir. Hücre içinde p60-katanin ile p80-katanin heterodimer oluşturmaktadır, böylece p60-katanin ATPaz aktivitesi sayesinde mikrotubulleri kesebilmektedir. Laboratuvarımızda yüksek lisans tezi olarak gerçekleştirilen p60-katanin ile etkileşen proteinleri aydınlatmak için kullanılan Y2H (maya ikili hibrid) tarama sistemi ile insan beyin cDNA kütüphanesi taranmış ve p60-katanin ile 22 proteinin etkileşimi aydınlatılmıştır. p60-katanin ile etkileştiği tespit edilen bu proteinlerden Septin3, presinaptik terminallerde bulunması, sinaps formasyonundaki rolleri, akson hedeflenmesindeki ve nöronal diferansiyasyondaki etkileri göz önünde bulundurularak bu çalışmada incelenmek üzere seçilmiştir. Septin3, Septin ailesinin bir üyesi olup GTPaz özelliğine sahip bir proteindir. Memelilerde 13 adet Septin geni 30'dan fazla Septin izoformunu kodlar. Septinler hücre içinde hetero-oligomerler ya da homo-oligomerler halinde bulunur. Oligomer oluşumu sırasında da GTP hidrolizi sonucu açığa çıkan enerjiyi kullanırlar. Bu açıdan GTPaz aktivitesi septinler için önem taşımaktadır. Septinlerin GTPaz aktivitesini etkileyen birçok amino asit bulunmaktadır. Bu amino asitlerin GTPaz aktivitesi üzerine etkileri Septin alt sınıfları arasında farklılık göstermektedir. Septin proteinlerinin çoğu birçok dokuda eksprese edilmektedir. Biyokimyasal saflaştırma çalışmaları göstermiştir ki, septinler hetero-oligomer oluşumu sırasında eksprese edildikleri hücreye göre farklılık göstermektedir. Septinler, gen sekanslarındaki benzerliğe göre SEPT2, SEPT6, SEPT7 ve SEPT3 olmak üzere dört alt sınıfa ayrılmışlardır. Bu açıdan oluşan septin filamentleri; SEPT2/6/7/3 olmak üzere belirli bir kombinasyon doğrultusunda oluşmaktadır. Septin3 özellikle beyinde eksprese edilmektedir. Diğer septinler gibi hetero-oligomer oluşumuna katılmaktadır ve hetero-oligomerin uçlarında yer almaktadır. Bunun yanı sıra, bazı septinlerden farklı olarak homo-dimer de oluşturmaktadır. Septinlerin birçok hastalık ile ilişkileri ortaya koyulmuştur. Özellikle merkezi sinir sisteminde yoğun olarak bulunan Septinlerin Parkinson, Alzheimer, şizofreni ve kalıtsal nörolojik amtropy gibi hastalıklarla ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmada, Septin3 ile p60-katanin'in etkileşimini aydınlatabilmek için öncelikle sıçan beyin lizatının kullanıldığı ko-immünopresipitasyon (ko-IP) yöntemiyle Septin3 - p60-katanin etkileşimi incelenmiştir. Ko-immünopresipitasyon sonucunda, Septin3 ve p60-katanin proteinleri birbirlerine bağlanmışlardır. Sadece boncuk ve spesifik olmayan IgG kontrollerinde de bağlanma gözlemlenmemesi, etkileşimin spesifik olarak Septin3 ve p60-katanin arasında gerçekleştiğini ortaya koymaktadır. Sonuç olarak, Septin3 ve p60-katanin sıçan beyninde etkileşmektedir. Ardından immünositokimya deneyleri ile Septin3 ve p60-katanin proteinlerinin lokalizasyonu primer kortikal nöronlarda gözlemlenmiştir. İmmünositokimya deneylerinde endojen Septin3 ve p60-katanin proteinleri spesifik antikorlar kullanılarak görselleştirilmiştir. Nöron görüntülerine göre Septin3 proteinleri literatürde de belirtildiği gibi aksonlarda gözlemlenmiştir. Septin3 ve p60-katanin proteinleri özellikle nöronların gövdesinde ko-lokalize olarak bulunmaktadır. Ardından, Septin3 proteini, büyük hücre yapısına sahip olan ve görüntülenmesi açısından sağlayacağı avantaj düşünülerek RFL6 hücrelerinde fazla-eksprese ettirilmiş ve immünositokimya deneyleri ile Septin3'ün hücre içindeki formasyonu gözlemlenmiştir. Septin3 proteini, literatürde bazı septinler için belirtildiği gibi filament yapı oluşturmuştur. Septinlerin filament oluşumunda GTPaz aktivitesi önemlidir. Bu açıdan Septin3 proteininin GTPaz aktivitesi için kritik olan iki amino asit, lizin 208 ve arjinin 280, ayrı ayrı ve birlikte mutasyona uğratılarak, mutasyonların Septin3'ün GTPaz aktivitesi üzerine etkisi ölçülmüştür. Arjinin 280'de gerçekleştirilen mutasyon, lizin 208'de gerçekleştirilen mutasyona oranla Septin3'ün GTPaz aktivitesini daha çok düşürmüştür. En düşük GTPaz aktivitesi, her iki amino asidin mutasyona uğratılması sonucu kaydedilmiştir. Bu sonuçlardan yola çıkarak, her iki mutasyonu içeren Septin3 proteini RFL6 hücrelerinde fazla-eksprese ettirilerek immünositokimya deneyleri ile gözlemlenmiştir. Mutant Septin3 proteinleri nokta şeklinde hücre sitoplazmasında ve hücre zarında mikrotubullerle ko-lokalize olarak birikmiş şekilde gözlemlenmiştir. Ardından, wild-type ve her iki mutasyonu içeren Septin3 konstrakları RFL6 hücresinde p60-katanin ile birlikte fazla-eksprese ettirilmiş ve hücreler immünositokimya analizlerine tabi tutulmuştur. Wild-type Septin3'ün ve p60-katanin'in birlikte eksprese ettirildiği hücreler sadece wild-type Septin3 eksprese eden hücrelere kıyasla daha küçük gözlemlenmiştir. Ayrıca bu hücrelerin düzensiz bir mikrotubul dinamiğine sahip olduğu da görülmüştür. Bunun yanı sıra, Septin3 proteini sadece Septin3 eksprese ettirilen hücrelerde uzun, fırça şeklinde filamentler ya da yoğun Septin3 demetleri şeklinde gözlemlenirken, p60-katanin ile birlikte eksprese ettirildiklerinde hücre içinde kısa Septin3 filamentleri oluştuğu gözlemlenmiştir. Her iki mutasyonu birden içeren Septin3'ün ve p60-katanin'in birlikte fazla-eksprese ettirildiği hücrelerde beklenildiği üzere Septin3'ün filament oluşturamadığı gözlemlenmiştir. Yanı sıra, mikrotubullerin düzensiz ağ yapısına sahip olduğu ve Septin3 proteinleriyle ko-lokalize olduğu gözlemlenmiştir. Son olarak, Septin3'ün ve p60-katanin'in birbirleriyle etkileşen bölgelerini aydınlatabilmek için p60-katanin'in farklı fonksiyonel bölgelerini içeren gen sekansları FLAG etiketli memeli ekspresyon vektörüne, Septin3'ün farklı fonksiyonel bölgelerini içeren gen sekansları Myc/His etiketli memeli ekspresyon vektörüne aktarılmıştır. Full length Septin3 ile p60-katanin'in konstrakları ve p60-katanin ile Septin3'ün konstrakları olacak şekilde kolay transfeksiyon olabilen HCT116 hücrelerinde fazla-eksprese ettirilmişlerdir. Hücre lizatları toplanmış ve ko-IP analizleri gerçekleştirilmiştir. Ko-IP deneylerinde FLAG etiketli p60-katanin proteinleri FLAG etiketli rezin ile çöktürülmüş, birlikte çöken Myc/his etiketli Septin3 proteinleri ise Myc etiket antikoru ile tespit edilmiştir. Sonuçlara göre, p60-katanin proteini çoğunlukla Septin3 ile p60-katanin'in ATPaz bölgesi aracılığıyla etkileşmektedir. İlaveten, Septin3 proteini p60-katanin ile GTPaz bölgesi aracılığı ile etkileşime girmektedir.