Molecular cloning and recombinant production of human (EpCAM) extracellular domain

Epitelyal hücre adezyon molekülü (EpCAM, CD326), epitel hücrelerde Ca+2 'a bağımlı homotipik hücre-hücre adezyonuna aracılık eden ve yaklaşık 40 kDa boyutunda, tip I transmembran glikoproteinidir. EpCAM iki alt domainden oluşmaktadır; bir hücre dışı domain (EpEX) ve bir hücre içi domain (EpICD), bu iki domain bir transmembran sarmal ile ayrılmıştır. Sağlıklı dokularda, EpCAM hücreler arası sinyal iletimi ve hücre göçü gibi bir çok temel biyolojik proseste görev almaktadır. EpCAM'in epiteliyal tümör dokularında yüksek seviyede ekspresyonu ve sağlıklı epitel hücrelerinde düşükseviyede eksprese olması kanser tanısında bir biyolojik belirteç olarak kullanılmaktadır. Daha önce yapılan çalışmalar EpCAM'in iyi bir anti-tümör hedefi olarak görev yapabileceğini göstermiştir. Bu teknikler başlıca, immünoterapötik stratejiler, aşılama, RNA aptamerleri. Bu çalışmada, sonraki uygulamalarda kullanılması amacıyla (E. coli) tabanlı bir ekspresyon sisteminde rekombinant EpEX moleküllerini ifade etmeyi ve saflaştırmayı amaçlanmıştır. Bu amaçla, EpEX'i yüksek seviyede ifade eden iki farklı insan kanser hattından toplam fragmentleri, bakteriyel ekspresyon ve rekombinant proteinlerin saflaştırılması için bir plazmit vektörü olan pGEX-6P1'e entegre edildi. Doğru pGEX-6P1-EpEX klonunlarını içeren kolonilerin tespiti için öncelikle PCR taraması ve sonrasında restriksiyon enzimleri ile kesilen plasmidlere Sanger dizi analizi yapılarak doğru klonlar seçildi. Seçilen klonlar recombinant protein üretimi amacıyla E. coli BL21 strainine transfekte edildi. Rekombinant EpEX molekülü için en yüksek verimi ve saflığı elde etmek için, indüksiyon, ekspresyon ve saflaştırma koşulları optimize edildi. Üretilen GST-EpEX, glutatyon-agaroz taneleri kullanılarak afinite kromatografısiyle saflaştırıldı. Saflaştırılan rekombinant EpEX moleküllerini boncuklara bağlı kalan GST etiketinden ayırmak için HRV3C proteaz enzimi kullanıldı. Son olarak, izole edilen protein SDS-PAGE yapılarak doğrulandı.