Transkripsiyon faktörü p53 tümör supressör proteininin p60-katanin (KATNA1) promotoru ile etkileşimi

Hücre iskeleti, hücrenin hareketinde, şekil almasında, mitoz bölünmede, sitokinezde, hücre içi molekül taşınması gibi hayati fonksiyonlarda görev alan tüm sitoplazma boyunca yayılmış bir ağ yapısıdır. Hücre iskeleti üç farklı polimerik yapıdan meydana gelir. Bunlar mikrofilamentler, ara filamentler ve mikrotubuller olarak adlandırılırlar. Mikrofilamentlerin hücrenin şekil kazanması sırasında, sitokenezde , organellere tutunma yüzeyi hazırlanmasında, kas hareketleri gibi fonksiyonel birçok hücre içi görevleri vardır. Ara filamentler ise hücreye mekanik destek sağlarlar ve hücreler arası bağların oluşumunda görevlidirler. Bir diğer hücre iskeleti elemanı da mikrotübüllerdir. Mikrotubuller hücre bölünmesi esnasında kromozomların kutuplara çekilmesinde, hücrenin morfolojik yapısının oluşmasında, hücrede vezikül taşınmasında, hücrenin hareket edebilmesinde, nöronlarda akson oluşumunda ve nöronal şeklin meydana gelmesinde önemli rol oynarlar. Mikrotubuller alfa (α-tubulin) ve beta (β-tubulin) heterodimerlerinin oluşturduğu polimer yapılı proteinlerdir. α ve β heterodimerlerinin hızlı bir şekilde polimerizasyonu ve depolimerizasyonu ile mikrotubuller dinamik bir yapı kazanmaktadır ve bu dinamizme "dinamik kararsızlık" adı verilir. Hücreler ihtiyaç durumuna göre bu mekanizma ile mikrotubullerini yeniden yapılandırmaktadırlar. Mikrotubullerin uzayıp kısalmasından bu mekanizma sorumludur. Uzama fazı mikrotubullerin uçlarına serbest tubulin hetero dimerlerinin eklenmesiyle oluşurken, kısalma fazıında mikrotubuller uçlarından tubulin dimerlerini kaybederler. Mikrotubullerin kesilip kısalması bir diğer dinamik mekanizmadır ve nöron morfolojisi açısından çok önemlidir. Çünkü dinamik kararsızlık, nöron morfolojisinin oluşması için gereken dallanma sürecinde hız ve zaman açısından yetersiz kalır. Bu nedenle mikrotubullerin hücre içi hareketini açıklamaya çalışan diğer mekanizmalar devreye girmektedir. Bunlardan birisi de "kes ve koş" mekanizmasıdır. Mikrotubullerin kesilmesinde görev alan enzimler katanin, spastin ve fidgetindir ve bunlar AAA ailesi ATPaz üyeleridir. Mikrotubullerin kesilmesi hareketi açısından ve taşınabilmesi için önemli bir durumdur. Çünkü mikrotubullerin hücre içerisindeki hareketleri boyları ile ters orantılıdır. Uzun mikrotubuller harekete direnç gösterirken kısa mikrotubuller daha efektif bir şekilde hareket ederler. Ancak, mikrotubuller tekrar uzun hale geldiklerinde hareket yeteneklerini kaybetmektedirler. Katanin ve spastin benzer çalışma mekanizmaları içerirler. Ancak mikrotubullerin farklı form ve boyutlarda kesilmelerini sağlarlar. Spastin SPG4 geni tarafından kodlanır. Katanin ise heterodimerdir ve KATNA1 geni tarafından kodlanan p60-katanin ve KATNB1 geni tarafından kodlanan p80-katanin alt birimlerinden oluşur. p60-katanin enzimatik aktivite gösterir ve AAA ATPaz bölgesi içerir. p80-katanin ise enzimatik aktivite içermez ancak p60-kataninin aktivitesini düzenler. Yapılan araştırmalar sonrasında katanin, nörolojik hastalıklar ile ilişkilendirilmiştir. Kataninin sinir sisteminde oldukça yoğun olarak ifade edilir ve baskılandığı zaman mikrotubul uzunluğunda artışa neden olur. Bu artış ile birlikte akson gelişiminin olumsuz etkilenmesi ve mikrotubullerin sentrozomlarda birikmesi görülür. Bu nedenle, kataninin mikrotubullerin sentrozomdan ayrılması ve akson büyümesi için hayati önem taşır. Mikrotubullerin sabit kalmasını sağlayan tau proteini hiperfosforilasyon sonucu mikrotubullerden ayrılarak stabilizasyonu engeller. Böylece katanin mikrotubulleri kolayca kesebilir. Bu yüzden kataninin gen anlatım süreci ile düzenlenmesi önem taşımaktadır. p53, tümör baskılayan protein olarak hücrenin birçok mekanizmasında yer almaktadır. Hücre döngüsünün düzenlenmesinde, metabolizmada, apoptozun tetiklenmesinde, DNA replikasyonunda, bağışıklık cevaplarında, proliferasyonda ve diferansiyasyon kaskadında önemli görevleri vardır. Daha önce grubumuzun yaptığı çalışmalar sonucunda, nöronlarda PKC'nin yapısında ve aktivitesinde meydana gelen değişimlere bağlı olarak hücre siklusu belirteçlerinden siklin D1 üzerinde oluşan değişiklikler incelendiğinde, PKC aktivasyonu ile birlikte nöronal uzantıların retraksiyonu görülmüştür. Burada yapılan analizlerle de p60-katanin protein seviyesinde artış görülen hücrelerde nöronal farklılaşma ile de ilişkili p53 transkripsiyon faktörünün de arttığı gösterilmiştir. Buradan yola çıkarak, bu çalışmada ise p60-katanin'in regülatör bölgeleri tespit edilerek p53 transkripsiyon faktörünün KATNA1 geninin regülasyonu üzerine olan muhtemel etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Öncelikle p60-katanin promotor bölgesinde olası p53 bağlanma bölgeleri biyoinformatik yöntemler ile saptanmıştır. Bu da, KATNA1 geninin p53 tarafından regüle edilebileceğine dair önemli bir ipucu olmuştur. Daha sonra p60-katanin bölgeleri (336 bp promoter, 448 bp 5'UTR, 784 bp promoter + UTR, 2682 bp intron + UTR ve 3000 bp promoter + UTR + intron ) klonlanmıştır. p60-katanin promoter , p60-katanin UTR, p60-katanin promoter + UTR , p60-katanin promoter + p60-katanin UTR + p60-katanin intron bölgeleri polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılmış ve gerekli enzim kesimlerinden sonra hazırlanmıştır. Bundan sonra, p60-katanin ekspresyonunda etkili regülatör bölgeleri lüsiferaz assay ile karakterize edilmiştir. Lusiferaz assay yöntemi ile 5'-UTR bölgesinin transkripsiyon aktivitesini arttırdığı ve tahmin edilen promoter bölgesinin intron varlığında transkripsiyon aktivitesini düşürdüğü bulunmuştur. Bunun sonucunda, intron-1 bölgesinin repressor etkisi görülmüştür. Olası promotor bölgesi biyoinformatik programı ile analiz edildiğinde, guanin ve sitozin (CpG) dinükleotidlerince zengin olduğu bulunmuştur. Bunun yanı sıra yaptığımız analizler sonucunda bu bölgede bir CpG adacığın varlığı (-615 ile -918 bç arası) tespit edilmiştir. Chromosome Immunoprecipitation (ChIP) ve Elektrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) yöntemleri ile p60-katanin üzerinde p53'ün bağlandığı gözlemlenmiştir. Daha sonra da protein düzeyinde p53'ün ekspresyonunun artışı western blotlama yöntemi ile incelenmiştir. Diğer taraftan bu sonuçlar, gen ekspresyon sürecinin anlatıldığı transkripsiyon basamaklarını kapsayan mRNA düzeyinde gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile de gösterilmiştir. p53'ün proliferasyon ve diferansiyon kaskadı arasında kritik bir protein olması nedeniyle p53'ün p60-katanin üzerindeki etkilerinin incelenmesi nörodejenerasyonda nörit retraksiyonu ile karakterize diferansiyon değişikliklerinin p53'e bağımlı moleküler mekanizmasının da aydınlatılmasına olanak sağlayacaktır. Ayrıca, p60-katanin ve p53 proteini nöronal farklılaşma ve hücre bölünmesinde önemli rollere sahip olduğu için transkripsiyonel ve translasyonel regülasyonun anlaşılması bakımından da büyük önem taşımaktadır.