NFIB proteininin potansiyel bağlanma partnerleri olan ATXN3 ve MAD2B ile etkileşiminin araştırılması

Nükleer Faktör I (NFI) ailesi, DNA'da spesifik bölgelere bağlanan bir protein ailesidir. Bu proteinler, viral DNA replikasyonunda ve transkripsiyonel regülasyonda rol oynarlar. NFI transkripsiyon faktörü ailesi embriyonun gelişimi boyunca ve yetişkin kök hücre nişlerinde gen regülasyonunda görev almaktadır. DNA-bağlanma analizi deneyleri ile NFI proteinlerinin DNA üzerinde çift simetrik korunmuş bir dizi bölgesine bağlandığı ortaya çıkarılmıştır. Bu çift simetrik dizi, çift zincirli DNA üzerinde TTGGC(N5)GCCAA sekansı olarak bulunmaktadır. NFI proteinleri bu korunmuş bağlanma bölgesine homo ya da heterodimer olarak yüksek afinite ile bağlanmaktadır. Dört NFI geni, NFIA, NFIB, NFIC ve NFIX, Xenopus türünden insan'a kadar incelenen bütün omurgalılarda tanımlanmıştır. NFI ailesinin üyesi olan tüm proteinler, N ucunda DNA bağlanma ve dimerizasyon bölgesi ve C ucunda transkripsiyonel aktivasyon ve represyon bölgesi içermektedirler. N ucunda bulunan DNA bağlanma/dimerizasyon bölgesi, NFI genleri arasında güçlü bir şekilde korunmuş bir bölgedir. Bu bölge 200-220 amino asit bir uzunluğundadır. Bu bölgede bulunan 4 adet sistein tüm NFI DNA bağlanma bölgeleri arasında korunmuştur. Ancak bu DNA bağlanma bölgesi heliks-turn-heliks gibi diğer sınıf iyi tanımlanmış DNA bağlanma motifleri ile bir benzerlik göstermemektedir. Ek olarak, bu korunmuş bölge TGF-β sinyal yolağında görevli SMAD proteininde de bulunan MH1 motifini içermektedir. Buna karşılık, prolin bakımından zengin olan C ucu bölgesi, N ucu bölgesi ile karşılaştırıldığında daha az korunmuştur. Ayrıca, NFI proteinlerinde çeşitlilikler daha çok C ucu alanında oluşmaktadır. Bu proteinler büyük olasılıkla farklı transkripsiyon modülasyon alanlarını kodluyorlar. NFI transkripsiyon faktörlerinin gen anlatım örüntüsü hücre tipine göre değişmektedir. NFI transkripsiyon faktörleri, memeli gelişimi esnasında dokuya özel gen anlatımında önemli bir rol oynamaktadır. Özellikle, merkezi sinir sisteminde gen anlatımları ile kök hücrelerin farklılaşmasını kontrol etmektedir. NFI transkripsiyon faktörlerinin hedef genlerinin promotorlarına bağlanarak ifadelerinin aktivasyonuna ya da baskılanmasına yol açabilmektedirler. Literatürde, protein-protein etkileşimlerini keşfetmek için kullanılan maya ikili hibrit sistemi ya da Y2H yöntemi ile NFI faktörlerinin histonlar ile etkileştiği gösterilmiştir. Ayrıca bu etkileşim transfekte edilen memeli hücre deneyleri ile doğrulanmıştır. Daha sonra maya iki ikili hibrit sistemi ile bir insan fetal beyin cDNA kütüphanesi taranmıştır. Tarama esnasında NFIB yem olarak kullanılmıştır. Bu tarama sonucunda yem olarak kullanılan NFIB ile güçlü bağlanma gösteren proteinler tanımlamıştır. Potansiyel partnerler arasından olası etkileşimlerin araştırılması için ATXN3 ve MAD2B proteinleri seçilmiştir. ATXN3 proteini, poliglutamin protein ailesinin bir üyesidir ve bu protein ailesi dokuz farklı nörodejeneratif genetik hastalık ile ilişkilendirilmiştir. ATXN3 proteini genel olarak sitoplazmik bir proteindir. Yaygın bir biçimde nöral ve nöral olmayan insan dokularında ifade edilmektedir. ATXN3 gen anlatımının seviyesi insan beyninin farklı kısımlarında çeşitlilik göstermektedir. İnsan beyninde ATXN3 gen anlatımı, spesifik nöron alt popülasyonlarında gözlenmiştir. Ayrıca, ATXN3 proteininin ubikuitin- proteazom sistemi ilişkisi ve transkripsiyon düzenlenmesinde rol oynadığı ve etkisi gösterilmiştir. MAD2B bir insan genidir ve MAD2L2 ve Rev7 olarak da adlandırılır. Bu protein, spindle checkpoint geni olarak adlandırlan MAD2 ile homologdur. İnsan MAD2B proteini, MAD2 (mitotic arrest deficient 2) proteini ile amino asid dizisi bakımından %53 oranında benzerlik göstermektedir. MAD2B, hücre döngüsünde spindle assembly checkpoint (SAC) olarak adlandırılan kontrol noktaları için önemli bir aracıdır. MAD2B proteini birçok hücresel fonksiyonlarda da yer almaktadır. Bu fonksiyonlardan biri olan hücre döngüsü regülasyonunda, Cdc20/Cdh1 proteinlerinde bağlanarak anafaza geçiş kompleksini (APC) durdurduğu gösterilmiştir. Bu protein, memeli hücrelerde DNA hasar yanıtında da önemli bir işleve sahiptir. Ek olarak, MAD2B proteini yapısal ve fonksiyonel olarak HORMA bölgesini taşımaktadır. ATXN3 ve MAD2B transkripsiyonel regülasyon özellikleri ile gelişimsel süreci düzenlemektedirler. ATXN3 ve MAD2B proteinlerinin yokluğunda anormal beyin gelişimi ve hücre oluşumu bozukluklarına yol açmaktadır. Ayrıca ATXN3 ve MAD2B mutant (-/-) farelerde fenotip incelendiğinde her iki proteinin de embriyonik gelişimde rol aldığı gözlenmiştir. MAD2B geninin susturulduğu farelerde, embriyolarında primordiyal eşey hücrelerinin (PGCs) farklılaştıktan sonra kaybolduğu ve epigenetik programlamanın sürdürülemediği gözlenmiştir. ATXN3 ise, deubikitinasyon aktivitesi nedeniyle sinir sisteminde önemlidir. ATXN3 mutant (-/-) farelerde yapılan çalışmalarda nöronal işlev bozuklukları ve nörodejenerasyon gözlenmiştir. Bu çalışmada NFIB ile ATXN3 ve MAD2B etkileşimini gösterebilmek için, birlikte immünçöktürme ve GST ile çöktürme deneylerini gerçekleştirdik. Bu deneylerin sonucunda, epitop etiketli MAD2B, ATXN3 ve NFI proteinleri birlikte ifade artırımı yapıldıktan sonra proteinlern bağlanmaları birlikte çöktürme deneyi ile analiz edilmiştir. İmmünçöktürme deneylerinin sonucunda, MAD2B ve NFIB proteinlerinin birlikte çöktüğünü gözlemledik. İki proteinin de karşılıklı olarak birbirlerini çöktürdüğünü de gösterdik. Diğer NFI proteinleri, NFIA, NFIC ve NFIX proteinlerinin MAD2B ile birlikte çökmediği yani bir etkileşimin olmadığını gözlemledik. Bu deneylere ek olarak, mutant NFIB proteinleri ile birlikte çöktürme deneyini gerçekleştirdik. Deneyde kullanılan NFIB dominant negative mutant proteinleri ya yalnızca N-ucu DNA bağlanma dimerizasyon bölgesini (NFIB_N) ya da C-ucu transkripsiyon aktivasyon ve baskılama bölgesini içermektedir (NFIB_C). Bu deneylerde mutant NFIB proteinlerinin her ikisinin de MAD2B protein ile birlikte çöktüğü gözlenmemiştir. Diğer yandan, GST-ATXN3 füzyon proteininin ve NFI proteinleri birlikte çöktürme deneylerini gerçekleştirdik. GST çöktürme deneyleri sonucunda GST-ATXN3 proteinin hem NFIA hem de NFIB proteinini çektiği gözlenmiştir. Hangi NFIB bölgesinin bağlanmada etkili olduğunu gözlemlemek amacıyla, immünçöktürme deneyinde de kullanılan NFIB dominant negative mutant proteinlerinin GST-ATXN3 ile etkileşimi ölçülmüştür. Deney sonucunda hem NFIB_N, hem de N terminal bölge ile Engrailed represör bölgesini içeren NFIB_Eng füzyon proteinin (NFIB_E), GST etiketli NFIB protein ile birlikte çöktüğü gözlenmiştir. Sadece C ucu içeren mutant NFIB, GST-ATXN3 ile birlikte çökmemiştir. Bu nedenle, yalnızca C ucunun ATXN3 ile etkileşim için yeterli olmadığı sonucunu çıkarmaktayız. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, NFIB proteinin farklı etkileşim partnerleri tarafından regülasyonu ve dolyısıyla NFI ailesinin nöral gelişimdeki rolünü aydınlatmaya katkıda bulunacaktır.