Meme kanserli hastalardan alınan sağlıklı ve tümörlü dokularda anti-apoptotik BAG-1 proteininin rolü ve lokalizasyonunun incelenmesi

Meme kanseri, dünyadaki en yaygın ikinci kanserdir ve kadınlarda en sık görülen kanserdir. Daha az gelişmiş bölgelerde, kadınlarda en sık ölüm nedeni ve akciğer kanserinden sonra daha gelişmiş bölgelerde kanser ölümünün ikinci nedenidir. Türkiye'de ise kadınlarda en sık görülen kanser yine meme kanseridir. İmmünohistokimyasal biyobelirteçler östrojen reseptörü, progesteron reseptörü, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü ve Ki-67, hastalığın durumu için tümör derecesi, boyutu ve nodal durumu kombinasyonu ile ilişkili olarak düşünülür. Günümüzde yirmiye yakın meme kanseri türü belirtilmiştir. Fakat bu çalışma için temel olarak, gen ekspresyon profillerine ve moleküler sınıflamaya dayalı olarak tanımlanmış dört alt grup seçilmiştir: Luminal A, luminal B, HER2 pozitif ve üçlü negatif meme kanser tipleri. Östrojen ve progesteron reseptörleri, hücre büyümesi ve proliferasyonunda rol alan steroid hormon reseptörleridir. PR, ligand ile aktifleşen transkripsiyon faktörüdür ve proliferatif sinyal yolağında, sinyal transdüksiyon yolunu aktive eder. Hücrede MAPK yolağının aktivasyonunu indükler. ER, PI3K / AKT sinyalini indükler ve meme kanseri hücrelerinde hücre büyümesini uyarır. Ayrıca dimerize haldeki aktifleşmiş HER2 reseptörü de RAS ve PI3K yollarını fosforile ederek alt yolaklarının aktiflenmesinde rol oynar. Çekirdekte, steroid hormon reseptörleri hormona duyarlı enhancer sekanslarını tanır ve bağlanarak hormone ilişkili transkripsiyonu artırır. Normal meme epitelyumuna kıyasla, ön-invaziv meme hastalıkları ve meme kanserinde Bcl-2 ile ilişkili anthanogen BAG-1 yaygın olarak artmaktadır. Ek olarak, Bag ailesi proteinleri, bir dizi insan kanserinde ve tümör hücre hatlarında, özellikle de lösemi, meme, prostat ve kolon kanserlerinde farklı olarak eksprese eder. BAG ailesi, çok çeşitli hedef moleküller ile etkileşime giren ve apoptozu, proliferasyonu, transkripsiyonu, metastazı, motiliteyi ve otofajiyi düzenleyen çok fonksiyonlu bir protein grubudur. BAG-1 ayrıca Bcl-2'den bağımsız anti-apoptotik etkilere sahiptir. Çok sayıda reseptör tirozin kinazına bağlanır ve apoptozun inhibisyonunda rol alır. Çalışmalar, BAG-1'in erken meme kanseri prognozunda klinik amaçlarla bir biyobelirteç olarak kabul edilebileceğini göstermektedir. Meme kanseri durumunda, BAG-1, AKT, BCL-2, B-RAF ve C-RAF, steroid hormon reseptörleri ve diğer proteinler ile etkileşime giren ısı şok protein HSP70 için bir eş-şaperondur. Öte yandan, ER fonksiyonunu düzenleyerek östrojen bağımlı transkripsiyonu arttırır. BAG-1 ve PR, ER arasındaki ilişkiler konusunda literatürdeki çalışmaların sonuçları değişkenlik göstermektedir. Bu konuyu ele almak için, BAG-1 ve BAG-1 ile ilişkili sağkalım faktörleri, laboratuvarımızda reseptör tipleri farklı meme kanseri hücre hatları ile çalışıdı. Ön çalışmalarımız bizi meme kanseri hücre sağ kalım yolağında BAG-1etkisi üzerine düşünmeye itmiştir. Alternatif translasyon mekanizması ile üretilen BAG-1'in üç izoformu, hücrede çeşitli bölgelerde lokalize haldedir. Hücre içinde farklı lokalize olabilen BAG-1 izoformları fonksiyonel olarak fark gösterir. Tek bir mRNA transkriptinden alternatif translasyon başlangıcı ile, 3 majör ve 1 minör izoform elde edilir. Bütün izoformlar BAG bölgesine sahiptir, fakat BAG-1L'de ve BAG-1M'de nükleer lokalizasyon sinyali bulunur. Böylece, BAG-1L nükleusta yer alır ve BAG-1M de çekirdeğe göç edebilir. BAG-1'in izoformları, lokalize oldukları doku ve hücrelere göre özelleştiği bilinmektedir. Hücre yolaklarınındaki rolü nedeniyle BAG-1, hücre sağkalımını düzenleyerek hastalıklar için önemli bir biyo-belirteç olarak kabul edilir. Apoptotik protein BAD'ın mitokondriyal membranda BCL-2 ve BCL-XL ile dimerize halde bulunmaktadır. Bu dimerizasyon, hücrede BAD aracılı apoptozu teşvik eder. BAD'ın, Ser112 ve Ser136 residülerinin BCL bağlama bölgesinde olduğu düşünülmektedir ve bu residülerinden fosforile olan BAD, mitokondriyal membrana BCL yoluyla bağlanamaz ve sitoplazmada kalır. Sitoplazmik BAD ise bu sayede hücre sağkalımında rolü bilinmektedir. Laboratuvarımızda yapılan önceki çalışmalarda, Bag-1 ve onun etkileşim partnerlerinin hücre sağkalımı ve apoptoz yollarında önemli rolleri olduğu gösterilmiştir. Çalışmalar, meme epitel MCF-10A, tümörijenik MCF-7 ve triple negatif MDA-MB-231 hücre hatları kullanılarak gerçekleştirildi ve p-AKT, BRAF, CRAF, BCL-2 ile BAG-1 etkileşimleri bu çalışmalarca doğrulandı. Ayrıca, etkileşim kompleksinin bir üyesi olan AKT, Ser 136 residüsünden BAD'ı fosforile ettiği, BAD'ın Ser 112 residüsünün ise p-CRAF vasıtasıyla fosforile edildiği de ekibimizin yaptığı çalışmalarca tekrarlandı. Bu iki lokasyondan birisinden fosforile olan BAD'ın, hücre sağkalımını artırmaktadır. Bu, bize meme kanseri hasta dokularında da bu yolakların doğrulamasının yapılabileceği hususunda fikir verdi. Başlangıçta, "Bu yolaklar meme kanserli hasta dokularında doğrulanabilir mi?'' ve "Hormon reseptörlerine bağlı meme kanserlerinde BAG-1 expresyonu ve ilişkili bu sağkalım yolağı reseptör bağımlı olarak değişkenlik gösterir mi?" soruları ile yola çıkıldı. Bu çalışmada, ER, PR, HER2 bağımlı meme kanserlerinde BAG-1'in ve sağ kalım yolağındaki BAD ilintili faktörlerin ekspresyon paternleri hastaşardan alınan tümörlü ve tümörsüz dokularda incelenmesi amacıyla yola çıkıldı. Bu amaca ulaşmak için BAG-1, BAD, AKT, BRAF, CRAF ve fosforile edilmiş formları ER, PR, HER2 bağımlı farklı tipteki kanser hastalarından alınan normal ve tümörlü meme dokularında araştırıldı. Eşzamanlı olarak, ortak tümör ilişkili genlerdeki mutasyon taraması için, genetic materyal eldesi aynı hastaların kan numunelerinden izole edildi. Bu çalışma, böylelikle hem protein temellli çalışma hem de genetic çalışma yapılarak iki iş akışından oluşmaktadır. Tümör doku örnekleri İstanbul Sağlık Bakanlığı Üniversitesi Ümraniye Eğitim ve Araştırma Hastanesi'nde gerçekleştirilen cerrahi işlem sonrası özel saklama solüsyonlarına alındı. Hem normal hem de tümör doku örneklerinin protein izolasyonu hemen yapıldı. Sonrasında immünoblotlama çalışmaları gerçekleştirilmek üzere protein izolasyonları soğuk zinciri bozulmadan kısa süre içerisinde gerçekleştirildi. Ayrıca immünhistokimya çalışmaları ile lokalizasyon çalışmaları yapıldı. Bu deneyleri yapmak için, dokular parafin bloklarına gömüldü. Formalin fiksasyonu yapılan dokular daha sonra ilgili antikorlarla boyanarak ışık mikroskobu altında incelendi. Öte yandan, aynı hastalardan alınan kan örneğinden izole edilen genetik materyal yoluyla major yaygın tümör baskılayıcı ve onkojenik genlerdeki varyasyonları saptamak için NGS çalışmaları gerçekleştirildi. Meme kanserinde yaygın sorumlu olan onkojen ve tümör baskılayıcı genler PCR bazlı çoğaltılarak, ve oligo dizileriyle işaretlenerek her örnek için ayrı ayrı kütüphaneler hazırlandı. Örnek bazlı kütüphaneler sonrasında birleştirilip örnek havuzu sekanslama teknolojisi kullanularak dizilendi. Dizileme cihazından alınan ham data variant çağırma uygulaması kullanılarak sıralandı ve sonrasında çeşitli databaseler ve varyant çağırma toolları kullanılarak potansiyel varyasyonu araştırmak için analiz edildi. Literatürdeki birçok küçük kohortlu çalışmalar, BAG-1'in meme kanserinde farklı sonuçları olan ekspresyonunu sergilemektedir. Araştırmacılar ve klinisyenler, nükleer BAG-1 ekspresyonu ile yüksek sitoplazmik Bag-1 arasındaki sağkalım veya ilişkinin azalması ve sağkalımın iyileştirilmesi gibi birçok farklı sonuca ulaşmışlardır. Ancak östrojen, progesteron, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü ve Bag-1 interaksiyonları önemli bir konu olarak ortaya çıkmıştır. Ayrıca, Bag-1, ER ve PR arasındaki ilişkilendirmeler de ihtilaf göstermektedir. Bazı çalışmalar Bag-1 ekspresyonu ile ER veya PR ekspresyonu arasında bir ilişki olmadığını gösterirken, diğer çalışmalar Bag-1 ve ER'nün BAG-1 ve PR ile birlikte ifade eğiliminde artış gösterdiğini ifade etmiştir. Bununla ilgili çelişkiler henüz aydınlanmamıştır. Bu çalışmada protein deneylerini yürütebilmek için 48 farklı hastadan doku örnekleri toplandı. Çalışmadaki ana bulgu, tümörlerde, BAG-1 L aşırı ifadesinin, nükleustaki BAG-1 lokalizasyonununa eşlik etmesidir. Ayrıca bu durum ER ile olan ilişki ile paraleldir. Lumainal A tipinde, BAG-1L, p-AKT ve p-BAD Ser 136 nükleusta lokalizasyonları tekrarlı çalışmalarca tümör dokularında gözlemlenmiştir. Buna bağlı olarak, muhtemel BAG-1, p-AKT, BAD/p-BAD Ser 136 üçlü kompleksinin, ER varlığında nükleer lokalize olabileceği ihtimali üzerinde yoğunlaşılmıştır. Bu bulgu ışığında BAG-1L'nin ER ile ilgili meme tümörlerinde biyobelirteç olma olasılığı üzerinde çalışmalar devam ettirilmektedir.