NFIX 3'utr bölgesi ile etkileşen mikrornaların araştırılması

Nükleer Faktör I (NFI) transkripsiyon faktörü ailesi embriyo ve yetişkinlerdeki önemli hücresel ve gelişimsel olayları kontrol etmektedir. Omurgalılarda bu aile NFIA, NFIB, NFIC ve NFIX proteinlerinden oluşmaktadır. NFI genlerinin basit prokaryot ve ökaryotlarda bulunmamasından dolayı bu gen ailesinin metazoan evrimi sırasında ortaya çıktığı düşünülmektedir. Her NFI proteinin N-ucu DNA'ya bağlanma ve dimerleşme bölgesi ile C-ucu transkripsiyon aktivasyon ve baskılanma bölgesi içerir. N-ucu DNA'ya bağlanma ve dimerleşme bölgesi tüm NFI proteinlerinde korunmaktadır, C-ucu bölgesi ise varyantlar arasında daha fazla farklılık göstermektedir. Tüm NFI proteinleri N-ucu domeni bölgesinde dört korunmuş sistein aminoasiti içermektedir; bunların üçü DNA'ya bağlanma, dördüncü sistein ise oksidasyon hassaslığı için gereklidir. NFI'lar genom üzerinde TTGGC(N5)GCCAA dizisine homo- veya heterodimer olarak bağlanmaktadırlar. NFI proteinleri merkezi sinir sistemi, diş, akciğer, kas ve iskelet dokularındaki kök hücre farklılaşmasında görev alan genlerin ifadesini kontrol etmektedirler. NFIlar hücre ve dokuya özgü olmak üzere çeşitli mekanizmalarla gen ifadesini kontrol ederler. Bu mekanizmalara örnek olarak genel transkripsiyon faktörleriyle etkileşim, diğer transkripsiyon faktörleriyle kompleks oluşturma, nükleozom yapısının değiştirilmesi, koaktivatör/korepresörlerle etkileşim, promotorun metilasyon örüntüsünün değiştirilmesi verilebilir. NFIA, NFIB ve NFIX embriyonik gelişimde boyunca merkezi sinir sisteminin çeşitli bölgelerinde ifade edilirken, yetişkin beyninde sadece kök hücrelerde bulunur. In vivo çalışmalarda Nfia, Nfib ve Nfix genleri silinen farelerde korteks, hipokampus, serebellum ve omurilik gibi bölgelerin gelişiminin, glia veya nöron farklılaşması, nöron göçü ve akson oluşumu mekanizmalarının bozulmasına neden olduğu gösterilmiştir. Nfic geni silinen farelerde ise beyinde bir bozukluk fenotipi görülmediği için bu NFI proteininin merkezi sinir sisteminde işlevi olmadığı düşünülmektedir. Nfia, Nfib ve Nfix yokluğunda farelerin serebral korteks bölgesindeki ventriküllerin genişlediği saptanmıştır, bu da nöral projenitör farklılaşmasındaki bozuklukları işaret etmektedir. NFI'lar beyincikteki nöronal göç ve terminal farklılaşması için gereklidir, serebellar granül nöronlarındaki hücredışı sinyal molekülü (Wnt) ve hücre adhezyon moleküllerinin (Ephrin-B1, N-cadherin ve Tag1) ekspresyonlarını indükler. Nfix hipokampüste hücre yenilenmesinde rol oynayan transkripsiyon faktörü Sox9 ifadesini baskılayarak nöron farklılaşmasını aktive eder. Nfix geni silinen post-natal farede projenitör hücre belirteçlerinin (Pax6, Hes1, Hes5 ve Sox2) artması, bunun projenitör hücre oluşumunun arttığı ve nöron ve glia farklılaşmasında bozukluklar olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, Nfix nöronal göçü düzenlerken, burun soğanındaki projenitör hücreleri yönlendiren bir nörotropik faktör olan Gdnf hedef genini tetiklemektedir. Omurilikte ise Nfia ve Nfib astrosit farklılaşma belirteci olan Gfap ifadesini arttırarak astrosit farklılaşma sürecini başlatmakta, daha sonra Nfix ekspresyonu Nfib tarafından indüklenmektedir. Nfix ise Gfap ve diğer astrosite özgü genlerin anlatımını aktifleştirerek terminal astrosit farklılaşmasında görev alır. Nöral gelişimdeki rolüne ek olarak, Nfix yetişkin hipokampusdaki kök hücrelerin farklılaşmadan sessiz durumda kalmasını sağlamakta, aynı zamanda nöral farklılaşmada da rol oynamaktadır. Hücre kültüründe, Nfix'in sessiz hücrelerde ifadesinin arttığı ve hücrelerin bölünmeden, sessiz kalması için gerekli ve yeterli olduğu saptanmıştır. Bunun yanısıra, Nfix geni koşullu olarak silinen farelerde Nfix'in nöroblast oluşumunu desteklediği, oligodendrositlere özgü genlerin (Olig1, Olig2, Ptprz1 ve Ntrk2) ifadesini engelleyerek oligodendrosit farklılaşmasını baskıladığı olarak gösterilmiştir. Buna ek olarak, Nfix eksikliğinde nöron sayısı azalmakta, dendrit ve proses dallanması süreçlerinde bozukluklar tespit edilmektedir. Görüldüğü gibi, NFIX yetişkin nörogenezinde kök hücrelerin bölünmeden sessiz kalması ve hücre kaderinin nöron veya astrosit olarak belirlenmesinde görev almaktadır. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda transkripsiyon sonrası düzenleme mekanizmaları ile miRNAların merkezi sinir sistemi gelişimi ve kanserlerinde hücre proliferasyonunu düzenlediği tespit edilmiştir. NFI'ların (Nfia ve Nfib) miRNAlar tarafından baskılanmasıyla nöral projenitör hücrelerin farklılaşmasının erken olması engellenmektedir. Ayrıca, NFIA tumör baskılayıcı genlerin ekspresyonunu baskılaması nedeniyle, NFIA-miRNA etkileşimi glioma tümorlerinin oluşumunda rol oynamaktadır. NFIX'i baskılayan miRNAların (miR1290, miRHCC1 ve miR744) özfagus, yumurtalık ve hepatosellüler kanserlerde NFIX'in tümör supresör rolü olduğunu göstermektedir. Şu ana kadar yapılan çalışmalarda, NFIX'i hedefleyen miRNAların merkezi sinir sistemindeki fonksiyonu henüz tespit edilememiştir. Daha önce yapılan çalışmamızda farklılaşan nöral kök hücrelerde NFIX ifadesinin baskılandığı gösterilmiş, NFIX'i post-transkripsiyonel olarak düzenleyen mekanizmaları aydınlatmak amacıyla NFIX 3'UTR bölgesindeki miRNA bağlanma bölgeleri analiz edilmiştir. Biyoinformatik analizler sonucu 16 adet miRNA'nın NFIX 3'UTR varyantlarında korunan bölgelere bağlanma potansiyeli olduğu saptanmıştır. İnsan nöral projenitör hücrelerinde yüksek düzeyde ifade edilen miRNAlar, miR25, miR92b, miR124, miR363 NFIX'i hedefleyebilecek miRNAlar olarak incelenmek üzere seçilmiştir. Buna ek olarak, NFIX'i baskıladığı daha önce gösterilmiş olan miR1915 pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. miRNAların NFIX ekspresyonuna etkisini görebilmek için raportör gen analizi yapılmıştır. İlk olarak, seçilen miRNAların bağlanma bölgelerini içeren NFIX 3'UTR parçası (~1300-2600 nt) insan genomic DNAsından çoğaltılarak TOPO vektörüne ve daha sonra raportör gen içeren pmiRGLO lusiferaz vektörüne klonlanmıştır. Ekspresyon baskılama düzeyini gösteren lusiferaz analizi için seçilen miRNAların mimikleri kullanılmıştır. Pozitif kontrol olarak kullanılan miR1915'in NFIX 3'UTR-I ile birlikte ifade edilen raportör genlerin translasyonunu baskıladığı görülmemiştir. Ne var ki, mimik aktivitesini teyit edebileceğimiz başka bir UTR konstraktı elimizde bulunmadığı için mimik aktivitesi teyit edilememiştir. miR25 ve miR363'ün NFIX 3'UTR lusiferaz aktivitesini baskıladığı saptanmıştır. Ön veriler, miR124 ve miR92b mimiklerinin NFIX ifadesine etkisi olmadığını göstermiştir. İleriki çalışmalarda, miRNAların NFIX 3'UTR ile etkileşiminin spesifik olup olmadığı miRNAların NFIX 3'UTR bağlanma bölgelerinin mutagenez ile değiştirilmesi yoluyla belirlenecektir. Ayrıca, NFIX 3'UTR'deki spesifik dizilere bağlanan miRNAların NFIX anlatımını baskılamasının fizyolojik etkisi de araştırılacaktır.