NFIB'nin CDO ve FGF19 gen düzenleyici bölgelerine bağlanmasının kromatin immün çöktürme yöntemiyle araştırılması

Nükleer faktör I transkripsiyon faktörü ailesi NFIA, NFIB, NFIC ve NFIX olmak üzere 4 üyeden oluşmaktadır. İki adet aynı ya da farklı NFI proteinleri DNA ipliğinde TTGGC(N5)GCCAA dizisine bağlanmaktadır. NFI proteininin (N) ucunda yaklaşık 210 amino asit uzunluğunda DNA bağlanma ve dimerleşme bölgesi, karboksi (C) ucunda ise gen ifadesini aktifleştiren veya baskılayan C ucu domeni bulunmaktadır. NFI proteinleriarasında amino asit dizilerinin benzerliği araştırıldığında, özellikle N-ucu domeninin benzerliğinin yüksek oranda korunduğu, N-ucunun aksine C-ucu domeninde benzerliğin daha az olduğu görülmektedir, bu durum NFI proteinlerine çeşitlilik sağlamaktadır. Bunun yanı sıra, alternatif kırpılma mekanizmaları sonucunda farklı NFI izoformlarının üretilmesi,NFI proteinlerinin çeşitliliğini arttırmaktadır. NFI proteinlerinin diğer proteinler ile benzerliğine bakıldığında, sadece SMAD proteinlerinin N-ucu bölgesinde bulunan MH1 motifiile benzerlik görülmüştür. Her iki transkripsiyon faktörü de korunmuş sistein-sistein-histidin-sistein, CCHC, amino asit dizisini içermektedir ve bu dizi DNA'ya bağlanma özelliği kazandırmaktadır. Merkezi sinir sisteminde embriyonik dönemde NFIA, NFIB ve NFIX nöral progenitor hücrelerinin bulunduğu ventriküler bölgelerde, nöronlarda ve glialarda ifade edilirken, yetişkin dönemde ise nöral kök hücrenin ve projenitor hücrelerinin lokalize olduğu subventriküler zonda bulunmaktadır. NFIC ifadesinin düşük olması nöronal gelişimde önemli bir rol oynamadığını göstermektedir. In vivo çalışmalar nöral NFI ifadelerinin susturulmasının, beynin farklı bölgelerinin (hipokampüs, neokorteks, arka beyin, gibi) gelişimini (nöronal farklılaşma, nörogenez, gliogenez, akzonal uzama ve hücre migrasyonu) etkilediğini göstermiştir. NFI proteinleri tarafından transkripsiyonu aktive olan genler farklılaşma, gliogenez, dendrit ve akson oluşumu ile ilgili mekanizmlarda rol oynarken; transkripsiyonu baskılanan genlerin kök hücrenin kendini yenilemesi veya projenitör hücrenin kendini sürdürmesi ile ilgili olduğu görülmüştür. Yetişkin kök hücrelerde ise embriyonik kök hücrelerin aksine, NFI proteinleri kök hücrelerin çoğalmadan sessiz kalmasını ve hayatta kalmasını teşvik etmektedir. NFI'ların astrosit oluşumunda önemli olduğu ve gliogenezi tetiklediği, bununla birlikte kök hücre yenilenmesini aktifleştiren genlerin (EZH2, SOX9, HES1) ifadesini baskıladığı görülmüştür. Omurilik gelişiminde, NFI proteinleri erken nörogenezde farklılaşmayı engelleyerek nöral prekürsör hücre sayısının artmasını sağlarken, geç nörogenez süresince astrosit oluşumu ile ilişkili genlerkontrol ederek gliogenez oluşumunu teşvik etmektedir. Buna ek olarak, NFI'lar ile oligodendrosit oluşumu ile ilgili olduğu bilinen OLIG2 transkripsiyon faktörünün ifadelerinin birbirini negatif olaraketkiledikleri görülmüştür. Bu nedenle NFI proteinleri oligodendrit ve astrosit oluşumu arasındaki dengeyi sağlamaktadır. Daha önceki çalışmalarımızda, NFIA, NFIB ve NFIX proteinlerinin üçünün de arka beyindeki preserebellar sistemde ifade edildiği ve bu proteinlerden sadece NFIB ifadesinin yokluğunda preserebellar çekirdek nöronlarının gelişiminde azalma ve gecikme görülmüştür. Bu sebeple NFIB'nin arka beyin gelişimindeki rolünün nörogenez ile ilişkili olabileceği düşünülmektedir. Ön araştırmalarda, NFIB ifadesinin yokluğunda mRNA ekspresyon analizi yapılarak preserebellar nöroprojenitörlerde NFIB'nin 33 adet hedef genleri tespit edilmiştir. Bu hedef genlerin içerisinden merkezi sinir sistemindeki fonksiyonları ve ekspresyonları sebebiyle iki hedef geni (CDO, FGF19) öncelikli olarak seçilmiştir. Nörogenezde temel bir rolünün olduğu düşünülen CDO hücre membran proteinidir ve merkezi sinir sisteminde ventriküler bölgelerde ifade edilir. CDO'nun beyin korteksinde sinyal kompleksi kurarak, bazik heliks-loop-heliks (Neurogenin-1) ve E protein (E47) heterodimerlerinin oluşumuna yol açıp, nöronal farklılaşmayı teşvik etmektedir. FGF19 ise büyüme faktörü ailesinin üyelerinden olup farede ifade edilen FGF15'in insanda ifade edilen formudur. FGF15'in beyin korteks gelişimi sırasında hücre çoğalmasını baskılayarak nöronal farklılaşmayı tetiklediği ve hücre döngüsünü kısalttığı görülmüştür. Bu çalışmada NFI'ların hedef gen olarak belirlenen CDO ve FGF19 promotörlerine bağlanıp bağlanmadığını araştırdık. Öncelikle her iki promoter için de ilk 5 kb'lik kısmını FIMO programı ile tarayıp CDO için 7, FGF19 için 8 bağlanma bölgesi elde ettik. Her iki gen için de düşük p value'e sahip olan ilk beş bölgeyi seçip türler arası homolojisine baktık.Öncelikle CDO geni için HEK293T hücrelerinde eksojen NFIB ile çalıştık, seçtiğimiz tüm bölgelere bağlandığını belirledikten sonra spesifik olmayan bağlanmalar belirlemiş olabileceğimiz için deneyi farklı epitopa sahip eksojen NFIB protein ile tekrarladık. 2. (IgG kontrole gore 6 kat fazla bağlanma görüldü)ve 3. bölgelerde, transkripsiyon başlama bölgesine yakın bölgeler, bağlanma görülürdü.ChIP deneyi daha sonra nöral projenitör hücrelerde yapıldı, NFI'ın daha önce de bağlandığını gördüğümüzpromotörün ilk 1 kb'lik alanda bulunan 2. ve 3. bölgeler ile tutarlı olarak etkileştiği belirlendi. Ardından projenitör ve farklılaştırılmış hücrelerdeki bağlanmayı karşılaştırmak için her iki hücre ile ChIP analizi yapıldı, hücreler arasında bağlanma sinyali açısından büyük bir farklılık görünmese de etkileşim olan bölgeler önceki çalışmalar ile tutarlı oldu. Nöral kök hücrelerde en çok ifade edilen aile üyesi NFIB iken, önceki çalışmalarda NFIB ekspresyonununfarklılaşmaya bağlı olarak azaldığı belirlenmiştir, Bu yüzden beklenilenin aksine ChIP analizinde projenitörlerde bağlanma sinyali daha az elde edildi, fakat bu durum, DNA'da aynı dizilere bağlanan NFI aile üyelerinden bazılarının, özellikle NFIA, ekspresyonunun farklılaşmaya bağlı olarak artması ile açıklanabilir. İkinci hedef gen olarak belirlenen FGF19 ile hNSC hücrelerinde yapılan ChIP analizinde ise transkripsiyon başlama bölgesi'ne en yakın bölgede tutarlı alarak bağlanma görüldü. HEK293T hücrelerinde ifade artımı ve hNSC hücrelerinde endojen NFI ile yapılan ChIP analizlerinden tutarlı sonuçlar aldıktan sonra, hNSC hücrelerinde ifade arttırımı çalışması yapıldı ve her iki gen için de belirlenen bağlanma bölgelerine bakıldı. Ön çalışma sonuçlarına göre, daha önce NFI'ların etkileştiği bölgelere ek olarak birer bölgeye daha bağlanma görüldü. NFIB CDO promotörü üzerinde daha once belirlenmiş 2. ve 3. bölgeye ek olarak 5. bağlanma bölgesi ile de etkileşti. Aynı şekilde FGF19 promotörü için 5. bölgenin dışında 1. bağlanma bölgesi ile de etkileşti. İlginç olarak bu bölgelerde ilk 1 kb'lik alan içinde bulunmaktadır. Ön çalışmadan elde edilen sonuçları doğrulayıp, lusiferaz raportör çalışması ile NFI'ların bağlanmalarının fonksiyonel olup olmadığına bakıyoruz.