MEFV geni intragenik CpG adacığı metilasyonunun mRNA transkripsiyonu ve pyrin lokalizasyonu üzerindeki olası etkisinin araştırılması

Ailevi Akdeniz Ateşi (AAA), genellikle akdeniz kökenli toplumlarda görülen, ateşli ataklarla seyreden bir enflamatuvar hastalıktır. Hastalığın en ağır komplikasyonu amiloidoz olup tedavi edilmezse ölümle sonuçlanabilir. Hastalığın tedavisinde genel olarak Kolşisin kullanılmakla beraber; Anakinra, Rilanosept, Etanersept, Infliksimab ve Tosilizumab gibi ilaçlar Kolşisin'e dirençli hastalarda kullanılmaktadır. MEditerranean FeVer (MEFV) geni, 1997 yılında Uluslararası ve Fransız AAA konsorsiyumları tarafından AAA'nın geni olarak tanımlanmıştır. Günümüze kadar 315 varyasyonu tanımlanan bu gendeki özellikle 5 varyasyonun ((c.2080 A>G, p.Met694Val; c.2082 G>A, pMet694Ile; c.2177 T>C, p.Val726Ala; c.2040 G>C, p.Met680Ile ve c.442 G>C, pGlu168Gln) hastalığa yol açtığı bildirilmiştir. Ancak AAA'nın çok sık görülmediği bölgelerdeki hastaların %5 ila 20'sinde hiçbir varyasyon gözlenmemektedir. Bu durum AAA'nın oluşmasında MEFV varyasyonlarının tek etken olmayabileceğini düşündürmektedir. MHC Class I Polypeptide-Related Sequence A (MICA) geni, MEFV ile epistatik etkileşime girebilecek modifikatör gen olarak önerilmiş, ancak anlamlı sonuçlara ulaşılmamıştır. Bu bağlamda, varyasyonlar dışında MEFV expresyonunda düzensizliklere yol açacak değişikliklerin, hastalığın gelişiminde rol oynayabileceği düşünülmüştür. MEFV genellikle beyaz kan hücrelerinde eksprese olmakla birlikte, kendisinin sinovyal fibroblast ve dentritik hücrelerde de ekprese olduğu bilinmektedir. Yapılan çalışmalar sonucunda AAA hastalarının MEFV ekpresyonunun sağlıklı kontrollere oranla daha az olduğu ve atak dönemlerinde bu ekspresyonun daha da azaldığı görülmüş, bu azalmanın enflamasyona bağlı olduğu öne sürülmüştür. Grubumuzun önceki yıllarda yürüttüğü, AAA hastaları (S=51) ve sağlıklı kontrollerin (S=11) kan örneklerinden izole edilen lökositlerdeki MEFV ekspresyonu çalışmasında benzer sonuçlar elde edilmiş, hastalardaki ekspresyon sağlıklı kontrollere orana daha düşük bulunmuştur (p=0.031). Ancak AAA hastaları ve sağlıklı kontrollerin periferal kan mononükleer hücrelerindeki (PBMCs) MEFV ekspresyonunu araştıran diğer bir çalışmada, hastalardaki MEFV espresyonunun daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Ekpresyonu etkileyebilecek mekanizmalardan biri de epigenetik mekanizmalardır. Bu mekanizmalar DNA metilasyonu, histon modifikasyonları ve kodlamayan RNA'ları içermekle beraber en sık rastlanan epigenetik mekanizma DNA metilasyonudur. DNA metilasyonunun en sık görüldüğü bölgeler gen promotörleridir. Ancak promotör dışındaki bölgelerdeki (intron ve ekzon) metilasyonun da transkripsiyonu etkilediği bilinmektedir. MEFV geminin ikinci ekzonunun tamamını kapsayan, 998 bp uzunluğunda bir CpG adacığı vardır (NC_000016.10, 3254057 – 3255054). Bu adacıktaki metilasyonun MEFV ekspresyonunu etkileyebileceği düşüncesiyle AAA hastaları ve sağlıklı kontrollerdeki MEFV ekspresyon datamızla CpG adacığındaki metilasyon miktarını karşılaştırdığımızda, ekspresyon ve metilasyon arasında iki grupta da negatif bir korelasyon olduğu (cor=-0.29, P=0.041) ve bu korelasyonun hastalarda daha yüksek olduğu (cor=-0.36, P=0.035) gözlenmiştir. MEFV'nin alternatif formları daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir. MEFV-fl tam boy proteini kodlarken, MEFV-d2 ekzon 2'yi içermeyen proteini; MEFV-8ext, MEFV-4a ve MEFV-2a intron içeren proteinleri kodlamaktadır. Gerçekleştirdiğimiz ekspresyon çalışmalarında farklı transkriptler incelenmemiş olduğundan, en sık gözlenen tam boy (MEFV-fl) ve ikinci ekzonu kırpılmış transkriptler (MEFV-d2) çalışma gruplarında tekrar araştırılmış ve MEFV-d2 transkriptinin hastalarda yüksek oranda eksprese olurken sağlıklı kontrollerde neredeyse hiç eksprese olmadığı gözlenmiştir (p=0.026). Artan metilasyon seviyesi ile doğru orantılı artış gösteren MEFV-d2 alternatif transkripti, MEFV CpG adacığı metilasyonu ile ekzon 2'nin alternatif kırpılması arasında bir ilişki olabileceğini düşündürmüştür. Bu bağlamda öncelikle alternatif kırpılmaya neden olabilecek varyasyonların varlığı araştırılmıştır. MEFV genindeki c.910G>A variantının (rs75977701) ekzon 2'nın kırpılmasıyla ilişkili olabileceği bildirilmiş; ancak çok nadir olan bu varyantın önceki AAA kohortumuzda olmaması, ayrıca bu ve benzeri varyantların Infevers veritabanı gibi hastalıkla ilişkilendirilmiş varyasyonların bildirildiği veritabanlarında bulunmaması, en azından Türk toplumundaki alternatif kırpılma ile ilişkili mekanizmalarda rol oynamadığını göstermiştir. MEFV genindeki metilasyonun ekzon 2'nin kırpılmasındaki olası rolünün araştırılması için öncelikle in vitro bir model oluşturulmuş, pSpliceExpress gen kaseti kullanılarak metilasyonun ekzon 2'nin tamamını içeren gen parçasının kırpılmasına sebep olduğu gösterilmiştir. Sonrasında farklı hücre modelleri oluşturularak hücrelerin kendi MEFV ekspresyonlarının hücre farklılaşması, metilasyon, dmetilasyon, aktivasyon ve histon deasetilasyonunun engellenmesi gibi durumlarda ne şekilde değiştiği incelenmiştir. Bu amaç doğrultusunda HL-60 promiyelosit hücreleri, dimetilsülfoksit (DMSO) ile nötrofil-benzeri hücrelere farklılaştırılmış, metanol ile global metilasyonu artırılmış, 5-aza-2′deoksisitidin (deazasitidin) ile global metilasyonu azaltılmış, forbol mistrat asetat (PMA) ve lipopolisakkarit (LPS) kullanılarak aktive edilmiş, son olarak trikostatin A (TSA) ile histon demetilasyonu engellenmiştir. Bu şekilde oluşturulan hücre modellerinde ikinci ekzonu içeren ve içermeyen transkriptlerin ekspresyonlarının kontrol hücrelere kıyasla nasıl değiştiği incelenmiş, ve alternatif kırpılmış transkriptin nötrofil-benzeri hücrelerinde 2 kat (p=0,0005), aktive edilen hücrelerde 2,5 kat (p=0,0034) ve metanol verilen hücrelerde de 2,5 kat (p< 0,0001) arttığı gözlenirken; deazasitidin verilen hücrelerde 1,7 kat (p=0,0126) azaldığı gözlenmiştir. TSA ile deasetilasyonu engellenen hücrelerdeki transkriptlerin seviyesinde anlamlı bir farkın gözlenmemesi, histon deasetilasyonunun, en azından oluşturulan hücre modelerinde, MEFV geninin ikinci ekzonunun alternatif kırpılması ile bir ilişkisi olmadığını göstermiştir. Yine aynı hücre modellerinde MEFV CpG adacığının ilk 61 CpG'yi kapsayan bölgesinin metilasyon seviyesi araştırılmış, belirli anlamlı artış/azalışlar görülmesine rağmen (Kruskal-Wallis test, p= 0,0184, Kruskal-Wallis statistic=9,567), deneyler arasında gözlenen yüksek varyasyondan dolayı bireysel örnekler arasında anlamlı bir fark görülmemiştir. Metanol ile global metilasyonu artırılan hücreler ve DMSO ile nötrofil benzeri hücrelere çevirilen hücreler arasında gözlemlenen ekspresyon ve metilasyon seviyeleri açısından benzerlik, metilasyonun nötrofile farklılaşma sürecinde bir rol oynayabilceğini düşündürmüştür. Bu hipotezi test etmek amacıyla metanol ile metilasyon seviyesi artırılan HL-60 hücrelerinin nötrofil-benzeri hücrelere dönüşüp dönüşmediği incelenmiş, ancak böyle bir değişimin olmadığı gözlenmiştir. Bu durum metilasyonun nötrofil değişim sürecinin sebebi değil, sonucu olabileceğini düşündürtmüştür. Son yıllarda gerçekleştirilen çalışmalar, metilasyon ile alternatif kırpılma arasında bir ilişki olabileceğini göstermiştir. Transkripsiyon ile kırpılmanın hücrede aynı anda gerçekleşmesinin bu ilişkiyi mümkün kıldığı düşünülmektedir. Metilasyonun alternatif kırpılmayı iki şekilde etkileyebileceği önerilmektedir: Metilasyonun RNA Polimeraz II elongasyonunu etkilemesi veya kırpılma faktörlerinin çağırması yoluyla zayıf olan ekzon kırpılma bölgelerinin transkripsiyon mekanizmaları tarafından tanınması, ekzonların kırpılmadan eksprese olmasına olanak sağlayabilecektir. Bu iki mekanizmada rol oynayabilecek proteinlerden bir kısmı belirlenmiştir. MEFV'nin metilasonunun ekzon 2'nin alernatif kırpılmasındaki rolüne yardımcı olabilecek bir proteinin belirlenmesi amacıyla ekzon 2'nin tamamını içeren gen parçası metilli ve metilsiz olarak nükleer proteinlerle inkübe edilmiş, bu gen parçalarına bağlanan proteinler ayrıştırılmış ve SDS-PAGE ile incelenmiştir. Her ne kadar metilsiz gen parçasına bağlanıp metilli gen parçasına bağlanmayan proteinler tespit edilse de yapılan kütle spektrometri (MS) analizlerinde uygun bir skor elde edilememiştir. Düşük skorlarına rağmen iki aday çinko-parmak (zinc-finger) protein belirlenmiştir. Kromatin immünopresipitasyon analizleri yapılarak bu ve benzeri proteinler detaylı olarak araştırılabilir. Nörolojik hastalıklar ve çeşitli kanser türleri gibi birçok hastalığın protein lokalizasyonundaki değişikliklerden kaynaklandığı bilinmektedir. MEFV-fl transkriptinin kodladığı pyrin-fl ve MEFV-d2 transkriptinin kodladığı pyrin-d2 proteinlerinin birçok hücrede farklı hücresel bölgelerde bulunduğu bildirilmiştir: pyrin-fl genellikle sitoplazmada gözlenirken pyrin-d2'nin nukleus ve sitoplazma arasında yer değiştirebildiği gözlenmiştir. Bu kapsamda HL-60 hücreleri ile nötrofil-benzeri ve aktive hücrelerde rekombinant pyrin-fl ve pyrin-d2 proteinlerinin lokalizasyonları araştırılmıştır. Pyrin-fl tüm hücrelerde sitoplazmada izlenirken pyrin-d2'nin HL-60 hücrelerinde nukleusta, nörofil-benzeri ve aktive hücrelerde ise sitoplazmada olduğu gözlenmiştir. Pyrin proteininin inflamasyondaki rolü henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bazı araştırmalar pyrin'in antienflamatuvar bir protein olduğunu öne sürerken, diğerleri enflamasyona sebep olabileceğini savunmaktadır. Yapılan çalışmalar Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain (ASC) proteininin pyrin ile etkileşime girerek enflamasyonun oluşmasında rol oynayabileceğini öne sürmüştür. Aynı zamanda pyrin-d2 izoformunun enflamatuvar durumlarda ekspresyonu artan ASC ile etkileşerek nukleusa gitmek yerine sitoplazmada kaldığı gözlenmiştir. Enflamasyonu baskıladığı gösterilen 14.3.3 proteinlerinin pyrin-fl ile etkileşebildiği, ancak pyrin-d2'nin etkileşim için gerekli olan bölgeyi içermediğinden etkileşmediği gösterilmiştir. Burada sunulan tezde elde edilen sonuçlar ve literatürdeki veriler ışığında, AAA hastalığına sebep olabilecek yeni bir mekanizma önerilmektedir. Önerilen bu mekanizmada yüksek metilasyon seviyesi pyrin-d2 miktarını artırmakta; enflamatuvar koşullarda ekspresyonu artan ASC tarafından sitoplazmada tutulan pyrin-d2, 14.3.3 proteinleri ile etkileşemediğinden enflamasyon baskılanamamaktadır. Bu şekilde, gen varyasyonları dışında AAA hastalığına sebep olabilecek yeni bir model oluşturulmuştur.