Mide patogenezinde PD-L1 ekspresyon seviyesinin belirlenmesi ile Helikobakter pylori ve T hücre cevabıyla arasındaki ilişkinin araştırılması

Mide Kanseri, dünyada ölüme sebep olan kanserler arasında üçüncü sıradadır. Bu kanser tipinde ölüm oranının yüksek olmasının nedeni geç tanı konulması ve dolayısıyla kötü prognozdur. Mide kanserinin oluşumu, genetik yatkınlık, çevresel faktörler, diyet ve yaş gibi birçok faktörün yanı sıra Helikobacter pylori (H.pylori) enfeksiyonu sonucunda oluşan kronik enflamasyon mide kanserinin gelişiminin tetiklenmesindeki temel unsurdur. H. pylori hastalıkla bağlantılı olabilecek pek çok virülans faktöre sahiptir. Bunlardan cagA virülans faktörünün varlığı mide mukozasında daha yüksek bir inflamasyona yol açarak mide kanseri oluşturma riskini arttırır. Bunun dışında en çok çalışılan virülans faktörlerinden bir diğeri de hücrelerde vakuoller oluşturan vacA 'dir. vacA virülans faktörü içeren H. pylori suşu ile enfekte olan midede gastrit oluşma riski daha yüksektir. Bunun yanı sıra bakterinin mide epiteline tutunmasında görevli olan babA adhezyonu ve napA virulans faktörü bakterinin kolonizasyonunu arttırarak mukozal inflamasyonu ve hastalığın prognozunu etkiler. Bakterinin dış membranında bulunan bir başka virulans faktör de oipA'dır. IL-8 salınımını cagA ile birlikte neden olan oipA duodenal ülsere ilerlemede etkilidir. Dış membranda bulunan hpaA bakterinin kolonizasyonunda görevlidir. H.pylori genomunun plastisite bölgesinde yer alan dupA, artan duodenal ülser riski ile ilişkilendirilmiştir. Bunun yanı sıra ureA ve ureB genleri bakterinin kendisini korumada kullandığı üreaz aktivitesi için gereklidir. Mide kanserinin gelişim basamakları sırasıyla kronik gastrit, atrofik gastrit, intestinal metaplazi, displazi olarak sınıflandırılmıştır. Türk toplumunda, yüksek insidanstaki H.pylori enfeksiyonundan kaynaklanan farklı seviyelerde mide prekanserojen lezyonlarına sahip hastalar bulunmaktadır. Bu hastalardan bir kısmı ileride mide kanseri geliştirme potansiyeline sahiptir. Ancak, bu hastaların, mide kanseri geliştirip geliştirmeyeceklerinin tayini, mide patogenezinin genetik ve immünolojik yönden tam olarak bilinememesinden dolayı mümkün olmamaktadır. Aynı zamanda H. pylori'nin virülans faktörlerinin karakteristiği ile konağın cevabı arasındaki bağlantıda da bilinmemektedir. Mide mukozasında H. pylori yüksek düzeylerde uzun süre yaşayabilir. Bu da konağın immün cevabının patojeni ortadan kaldırmada yetersiz olduğunu işaret eder. Bu immün cevapta görev alan sitokinlerin ekspresyonlarının değişiminden kaynaklanıyor olabilir. H.pylori enfeksiyonu, Th1 ağırlıklı edinsel immun yanıta yol açmaktadır; buna zıt olarak Treg hücreleri H.pylori'ye karşı konakta oluşan inflamasyonu engeller ve bakterinin mide ortamına uzun süre dayanıklı olmasını sağlar. Ayrıca, immün inhibitör kontrol noktası proteinlerinden aktif T ve B hücrelerinin yüzeyinde bulunan programmed death-1 (PD-1) ve ligandı programmed death-ligand-1 (PD-L1) arasındaki bağlantı T hücre cevabının negatif regülasyonuna yol açar. Bu nedenle bu çalışmada, Th1 hücrelerinn sitokini olan IFN-γ ve Treg transkripsiyon faktörü olan FOXP3 seviyeleri ile H.pylori enfeksiyonu arasındaki korelasyon prekanserojen lezyonlara sahip hastalarda incelenmiştir. Çalışmaya Acıbadem Maslak Hastanesi Gastroenteroloji bölümüne mide şikayetleri nedeni ile başvuran ve Endoskopi bölümünde gastroduodenoskopi uygulanan ve Acıbadem Maslak ve Atakent hastanelerinde kanser teşhisi ile mide kanseri ameliyatı geçiren 18-81 yaş arası, çalışma kriterlerine uygun, 20 aktif kronik gastritli, 3 inaktif kronik gastritli, 9 intestinal metaplazili ve 14 kanser hastası olmak üzere gastritli toplam 60 hasta dahil edilmiştir. Negatif kontrol olarak ise herhangi bir inflamasyona ve enfeksiyona sahip olmayan 15 kişi dahil edilmiştir. Endoskopi ve rezeksiyon yapılan hastalardan midenin antrum bölgesinden 3 adet doku örneği alınmıştır. Alınan doku örneklerinin birinden DNA, diğerinden RNA izolasyonu yapılmıştır; diğer biyopsi örneği ise hasta mide patogenezinin ve Helikobakter pylori'nin saptanması için Hematoxylin&Eosin histolojik boyama çalışmaları sırasında kullanılmıştır. İzole edilen DNA örnekleri on farklı virülans genini saptayabilmek için Konvansiyonel PZR çalışmalarında kullanılmıştır. Virülans faktörlerinin karakterizasyonunda pozitif kontrol olarak H. pylori'ye ait olan tüm virülans faktörlerini taşıdığı bilinen H.pylori G27 suşu kullanılmıştır. Hastalardan alınan dokulardan izole edilen RNA'lardan cDNA sentezi gerçekleştirilmiş ve FOXP3, IFN-γ ve PD-L1'ın mRNA düzeyinde ekspresyonlarının incelenmesi için kullanılmıştır. FOXP3, IFN-γ ve PD-L1'ın mRNA düzeyinde ekspresyonları gerçek zamanlı- PZR ile incelenmiştir FOXP3, IFN-γ ve PD-L1 ekspresyon analizeri için inflamasyon düzeyi yüksek olan hastalar seçilmiş ve konvansiyonel PZR ile gerçek zamanlı- PZR için optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Konvansiyonel PZR çalışmaları sırasında 10 farklı virülans faktörünün karakterizasyonu 24 H.pylori pozitif olduğu patoloji raporuna göre bilinen hastada gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalar sonucunda H.pylori tanısı yapılabilmesi için gerekli olan ureA ve ureB virülans faktörlerininin varlığı konvansiyonel PZR ile tespit edilmiştir. Konvansiyonel üreaz PZR çalışmalarının sonucu rutinde kullanılan histopatolojik boyama sonuçları ile karşılaştırılmıştır. Karşılaştırma çalışmaları sonuçlarına göre konvansiyonel üreaz PZR ve patolojik değerlendirme yöntemleri arasında güçlü bir uyum olduğu ortaya konmuştur. Konvansiyonel PZT çalışmaları sonucunda belirlenen virülans faktörleri iki farklı hasta grubu içerisinde değerlendirilmiştir. Aktif Kronik Gastritli hastalarda en çok saptanan virülans faktörleri; napA, hpaA ve cagA'dir. İntestinal Metaplazili hastalarda en çok saptanan virülans faktörleri; cagA, vacA ve hpaA'dır. Gerçek zamanlı-PZR çalışmaları ile Treg hücre gruplarının belirteçi olan transkripsiyon faktörü (FOXP3), Th1 hücre grubunun sitokini (IFN-ɣ,) ve PD-L1'ın mRNA düzeyinde ekspresyonları prekanserojen ve kanser hasta grupları içerisinde değerlendirilmiştir ve kontrol grup ile karşılaştırılmıştır. Karşılaştırma sonuçları t- testi ile analiz edilmiştir. Kontrol ile yapılan karşılaştırma sonuçlarına göre, Th1 hücre grubunun sitokini olan IFN-ɣ'nın ve ve Treg hücre gruplarının belirteci olan transkripsiyon faktörü FOXP3'ün ekspresyon seviyelerinin prekanserojen lezyonlara sahip ve mide kanserli hastalarda azaldığı tespit edilmiştir. Diğer yandan PD-L1'ın ekspresyon seviyesi ise prekanserojen lezyonlarda ve mide kanserinde daha yüksek bulunmuştur. Prekanserojen lezyonlara sahip ve kanserli hastalarda karşılaştırma yapıldığında, sadece FOXP3'ün ekspresyon seviyesinin prekanserojen lezyonlara sahip olan hastalarda daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Çalışmaya dahil edilen hastaların H.pylori enfeksiyonuna göre gruplandırması yapıldığında ise sadece IFN-ɣ'nın ekspresyon seviyesinin H.pylori ile enfekte olan hastalarda daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışma ile ilk defa H. pylori virülans faktörlerinin karakterizasyonu, immün cevaplarının durumu ve PD-L1 seviyeleri mide prekanserojen lezyonlarından mide kanserine doğru ilerleyiş basamaklarında incelenmiştir.