Telomer hedefli yeni ilaç adayı bileşiklerinin farklı kanser hücre hatlarında in vitro ve in vivo etkilerinin incelenmesi

Kanser, heterojenitesi ve metastatik özelliklerinin yanı sıra tedavi edilebilirliğinin sınırlı oluşu ile küresel olarak önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Kanser hücreleri telomeraz enzimi aktivitesi ile telomerlerini uzatmakta ve hücre siklusundaki kontrol noktalarından kaçarak immortal özellik kazanmaktadır. Kanser hücrelerinin %95'inde telomeraz ekspresyonu varken normal somatik hücrelerde baskılanmış olması nedeniyle, son yıllarda telomeraz/telomer hedefli tedaviler umut vaat etmektedir. Kanser hücrelerinin heterojenitesi ve farklı telomer uzunluklarına sahip olması nedeniyle, uzun süreli anti-telomeraz tedavilere bağlı yan etkiler görülebilmektedir. Bu nedenle telomerik uzunluklardan bağımsız olarak kısa sürede etki edebilecek telomerleri hedef alan yeni moleküllere ihtiyaç vardır. Bu doktora tezi çalışması kapsamında, telomerik yapılara telomeraz tarafından eklenen ve telomerik DNA hasarına neden olarak genomik kararsızlığa ve hücre ölümüne yol açabilecek moleküllerin in vitro ve in vivo olarak test edilmesi amaçlanmıştır. Bu moleküller, MAIA (Chicago, USA) biyoteknoloji firması tarafından sentezlenmiş ve Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı'na gönderilmiştir. Bu ilaç adayı moleküller, farklı kanser hücre hatlarına [meme kanseri (MCF-7), küçük hücre dışı akciğer kanseri (A549), rahim ağzı kanseri (HeLa) ve kolon kanseri (HT29)] 9 farklı konsantrasyonda 96 saat süre ile uygulanmış, sitotoksisite MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) ile değerlendirilmiştir. Elde edilen EC50 sonuçları her bir hücre hattında 6-thio-dG ile karşılaştırılmış ve L6 olarak adlandırılan molekül 6-thio-dG'ye oranla daha düşük EC50 değeriyle yeni potansiyel ilaç adayı olarak belirlenmiştir. Farklı hücre hatlarının L6 molekülüne karşı verdikleri yanıtlar değerlendirilmiş ve L6 molekülüne en duyarlı hücre hattı olan HT29 kolon kanser hücreleri hedef hücre hattı olarak seçilmiştir. Telomeraz enzimi ile telomerik uçlara eklenen bu moleküllerin, telomerik uçlarda yarattığı DNA hasarı, TIF (Telomer induced foci) yöntemi ile konfokal mikroskop kullanılarak incelenmiştir. Bu yöntemde telomerik prob ve DNA hasarına özgü γH2AX Ab ile yapılan boyamaların kolokalizasyonu ile TIF odakları gösterilmiştir. TIF yöntemi sonuçları, L6 molekülünün oluşturduğu telomerik DNA hasarının kontrol grubu ve 6-thio-dG'ye göre istatistiksel olarak daha yüksek olduğunu göstermiştir. Global genomik hasar incelendiğinde 6-thio-dG ile L6 molekülünün eşit ölçüde global DNA hasarı oluşturduğu gözlemlenmiştir. Ek olarak, kullanılan adayı moleküllerin baz eksizyon onarımı (BER) yolu proteinlerinden Apürinik/Apirimidinik endonükleaz 1 (APE1) ve Poli(ADP-riboz) polimeraz 1 (PARP1) üzerindeki etkileri ve DNA hasar ürünleri olan 8-hidroksi- 2'-deoksiguanozin (8-OH-dG), miktarları da sıvı kromatografi-yüksek rezolüsyonlu kütle spektrometre (LC-HR/MS) ve sıvı kromatografi-sıralı kütle spektrometre (LC-MS/MS) kullanılarak incelenmiştir. Buradan elde edilen sonuçlara göre L6 molekülü, HT29 hücrelerinde PARP1 ekspresyonunda artışa ve APE1 ekspresyonunda ise azalmaya neden olmaktadır. İn vitroda etkinliği gösterilen moleküllerin in vivo etkinliği CD1 nude fareler ve BALB/c üzerinde test edilmiştir. HT29 hücre hattı ile oluşturulan ksenograft modelde L6'nın optimal dozu 3 mg/kg ve tedavi süresi haftada 2 kere olmak üzere toplam 4 doz uygulama olarak belirlenmiştir. CT26 hücre hattı kullanılarak singeneik hayvan modeli oluşturulmuş, takiben L6 molekülü ile anti-PD-L1 kombinasyonel tedavisi uygulanmıştır. Hayvanlar sakrifiye edildikten sonra çıkarılan tümör dokularında flow-sitometre ile immünfenotipleme yapılmıştır. L6 molekülünün tümör boyutunda küçülmeye, Treg hücre miktarında azalmaya ve aktive CD8+ hücrelerinde artışa yol açtığı tespit edilmiştir. Anahtar kelimeler: Kanser, telomer, telomeraz, TIF (telomeric induced foci), DNA, ksenograft, singeneik, LC-MS/MS, APE1, PARP1, 8-OH-dG