Temel miyelin proteininin (MBP) izolasyonu pürifikasyonu ve bu proteine karşı spesifik antikorların oluşturulması

Temel miyelin proteinleri (MBP) miyelin kılıfının oluşumunda önemli rol oynayan dış membran proteinleridir. MBP izoformları Oligodendrosit (OLG) ailesinde bulunan Golli geninden 14-21,5 kDa arası değişen büyüklükte kalıtılan sorunlu proteinlerdir.. Miyelin proteinleri merkezi sinir sisteminde (CNS) çok tabakalı miyelin kılıfın konfigürasyonunda önemli bir yere sahiptir. MBP'nin 18,5 kDa'lik klasik izoformu ensefalitojenik belirteç olarak 50 yıldan fazla bir süre önce izole edildi. Bu protein merkezi sinir sistemi miyelininin yapısına katılan bir proteindir ve electron mikrograflarında gözlemlenen ana belirgin line oluşturmak için oligodendrosit tabakasının sitoplazmik leafletlarını biribirine bağlar. MBP'nin bu önemli rolü MBP geni susturulmuş, CNS miyelin oluşumu çok az olan ve yapısal olarak tam olmayan mutant farede ortaya çıkarılmıştır. Bu çalışmada MBP proteini rat beyninden 600 mg doku homojenize edilerek izole edilmiştir. Rat beyin homojenatı suda çözünebilen proteinleri ayırmak için santrifüj edilmiştir. Homojenat 14000 rpm'de 60 dk santrifüj edilerek pellet deneyde kullanılmıştır. Lipidleri ayırmak için pelete methanol-aseton solusyonu eklenmiştir. 45 dk +4 C0'de inkübasyondan sonra pellet 14000 rpm'de 30 dk santrifüj edilip pellet elde edilerek asit tamponu (pH=2) kullanılarak MBP ekstraksiyonu yapılmıştır. Elde edilen ekstrakt 60 dk +4 C0'de karıştırılmıştır. Ekstrakt 14000 rpm'de 30 dk boyunca santrifüj edildikten sonra MBP'nin SDS/PAAG yöntemi ile pürüfikasyonu için kullanılmıştır. Gel polipeptidinden 18 kDa olarak elde edilen protein tavşanda bağışıklık oluşturmak için antijen olarak kulanılmıştır. Western blotta antikor titresi, bir membran üzerinde boyanan ana MBP polipeptidlerinin yoğunluğunu azaltmaksızın görünür sonuçlar için maksimum seyreltme olarak belirlendi. Anti-MBP antikorları için maksimum seyreltme oranı 1:5500 olarak çalışılmıştır. IgG fraksiyonunun pürüfikasyonu ile 18,5 KDa izoformunu içeren rat beyninden MBP'nin spesifik antikorları elde edilmiştir. Elde edilen MBP'nin spesifik antikorları miyelin üretim bozukluğu ile alakalı hastalıklar ve oligodendrosit patolojisi çalışmak için başarılı bir şekilde kullanılabilir.