Modelling hTERT cancer-associated mutations via crispr-Cas9 in 3d liver organoids

İnsan TERT (hTERT) promotör mutasyonları C-124T ve C-146T, hepatoselüler karsinomda en sık görülen genetik değişikliklerdir. Bu mutasyonlar hepatokarsinogenezde erken olaylardan biri olarak kabul edilir ve hastalık progresyonu ile anlamlı şekilde ilişkilidir, ancak TERT'in tümörögeneze yol açan mekanizması net bir şekilde keşfedilememiştir. Son yıllarda gelişen üç boyutlu (3D) organoid teknolojileri ile, laboratuvar koşullarında, karaciğerde dahil çeşitli organların, küçültülmüş ve/veya basitleştirilmiş bir yapısal ve işlevsel versiyonunu üretmek mümkün hale gelmiştir. Buna göre, biz EpCAM pozitif endodermal hücrelerin ara basamak olduğu, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı hepatik organoid (eHEPO) kültür sistemi ürettik. eHEPO'lar 2 hafta içinde üretilebilir ve olgun hepatositlere farklılaşma kapasitesi kaybı olmadan uzun süre büyütülebilmektedir. Bu çalışmada, CRISPR-Cas9 bazlı genom düzenlemesini kullanarak hepatik organoidlerde hTERT promotör mutasyonlarını oluşturmayı amaçladık. TERT promotörünün düzenlenmesi için "pop-in pop-out" stratejisi adı verilen homoloji yönlendirmeli tamir (HDR) temeline dayanan CRISPR-Cas9 sistemi kullanıldı. Öncelikle bu sistem HEK293T hücrelerinde optimize edildi. Bu şekilde, promotörde C-146T mutasyonu içeren genomu modifıye edilmiş klonlar küçük delesyon mutasyonlarıyla beraber elde edildi. İkinci olarak, bu sistem hepatik organoidlerde denendi. Hepatik organoitlerin CRISPR-Cas9 ile kimyasal ve fiziksel bazlı transfeksiyon ajanları yoluyla transfeksiyonu farklı verimlilikler göstermiştir. Düşük transfeksiyon verimi, hepatik organoidlerde hTERT promoterini düzenlemek için engel oluşturmaktadır. Bu nedenle, organoidlerde daha yüksek transfeksiyon etkinliği elde etmek için daha fazla optimizasyon yapılması önemlidir. Bunlara ek olarak, TP53 genini hepatik organoidlerde benzer bir yaklaşımla nakavt edilmeye çalışılmıştır. Hepatik organoidlerin transfeksiyonu ve düzenlenmesi, CRISPR-Cas9 sisteminin hepatik organoidlerde çalıştığını ve izojenik organoid klonlarının elde edilebileceğini göstermiştir.