Kara havuç ekstraktının kompleks koaservasyon metoduyla nanoenkapsülasyonu: Tepki yüzey metodu ile optimizasyonu

Gıdalar geleneksel besin maddelerinin yanı sıra birçok bileşik içerir. Bu bileşiklerin birçoğu enzimatik ve kimyasal reaksiyonları değiştirme kapasitesine sahiptir ve bu nedenle insan sağlığını hem olumlu hem de olumsuz etkileyebilir. Polifenoller olarak da adlandırılan fenolik bileşikler, bitki metabolitlerinin en bol ve en yaygın gruplarından biridir. Antioksidan, antiinflamatuar, antibakteriyel ve antiviral fonksiyonlar gibi yüksek biyolojik aktivite yelpazesine sahiptirler. Bu bileşiklerin dengeli bir diyetin parçası olarak tüketildiğinde insan sağladığına faydalarıyla bilinmektedir ve oksidatif stres ile ilgili kanser ve kardiyovasküler hastalık gibi çeşitli kronik hastalıkların üzerine pozitif etkileri vardır. Fenolik bileşenler ve özellikle de antosiyanin çevre koşullarından etkilenerek çabuk bozulabilmektedir. Alkali ortam, sıcaklık, oksijen vb. pek çok faktör bozunma etkeni olabilir. Ayrıca, fenolik bileşikler sindirim süresince gastrointestinal bölgedeki koş ullarda ortam pH'sından etkilenmekte ve enzim ve diğ er nutrientlerin varlığ ı da bu bileşiklerin potansiyel sağlık etkilerini ve aktivitelerini engellemektedir. Bu kapsamda, sağlık açısından değerli olan bu bileşenlerin korunması hedeflenerek enkapsülasyon teknolojisinden faydalınabilinir. Enkapsülasyon teknolojisinde çeşitli biyoaktif maddeler kapsüller içeresinde haspedilir, böylece çevresel faktörlerden korunmuş olur. Serbest bileşikler yerine kapsüllü polifenollerin kullanımı instabilitelerinin dezavantajlarının üstesinden gelebilir, hoş olmayan tatları telafi eder, ayrıca bileşiğin biyolojik olarak kullanılabilirliğini ve yarı ömrünü in vivo ve in vitro arttırır. Enkapsülasyon metodunda kapsüllerin olabileceği boyutlar çok geniş bir aralığa sahiptir. Nano-, mikro-, makro-enkapsülasyon çalışmaları mevcuttur. Ancak gıdaların biyoyararlılığın ve biyoulaşılabililirliğinin artması yani bağırsaklardaki sindiriminin arttırılması amacıyla nano boyutta yapılan enkapsüllerin daha ve etken olduğu görülmektedir. Halihazırda fenolik bileşenlerin ve antosiyanininlerin enkapsülasyonunda kullanılan pek çok metot vardır: püskürterek kurutma, dondurarak kurutma, emülsyon oluşturma vb. Ancak bununla beraber, yapılan literatür taramasına göre koaservasyon metodu ile fenolik zengini kara havuç ekstraktlarının enkapsülasyonuna dair herhangi bir çalışma yoktur. Kara havuç geleneksel olarak ılıman bölgelerde yetiştirilmektedir ve doğal gıda renklendiricilerinin en önemlilerinden biri olarak görülmektedir. İçerdiği yüksek oranda fenolik bileşenler ve en önemlisi de antosiyanin miktarı, kara havucun hem sağlık açısından pek çok faydasını hem de renk maddesi olarak kullanılabilirliğini sağlamaktadır. Kara havucun ana antosiyaninin bileşeni asilatlı ve sübstitüe edilmemiş siyanidin türevleridir. Kara havuçta çoğunlukla bulunan antosiyaninler, ferulik, sinapik ve p-kumar asitlerle daha monoasillenmiş siyanürleme-3-ksilosil- galaktoz ve siyanürleme-3-ksilosil-glukosil-galaktoz olarak tanımlanabilir. Antosiyaninlerin yanında, p-kumarik asit, kafeik asit, ferulik asit, 3-hidroksibenzoik asit türevleri ve 1quercetin glikozit, klorojenik asit, mono- ve dihidroksisinnamoilkinik asit kara havuçta belirlenen diğer fenoliklerdir. Koaservasyon metoduyla fenolik zengini kara havuç ekstraktlarının enkapsülasyonun optimum koşullarının belirlenmesi amacıyla tepki yüzey metodu (RSM) kullanılmıştır. RSM son yanıtın optimize edilmesini amaçlayan matematiksel ve istatistiksel tekniklerden oluşan bir kombinasyonu temsil eder. Enkapsülasyon koşulları belirlenirken koaservasyon sağlanabilmesi için gerekli koşullar ve kullanılan hammadde göz önünde tutularak karar verilmiştir. Koaservasyon için ana kriterlerden biri olan pH parametresi asidik koşullarda olmak üzere farklı değerlerde çalışılmıştır. Koaservatlar oluşturulurken farklı kaplama materyali kompozisyonları kullanılarak optimum oran belirlenmiştir. Deneme deseni merkezi kompozit tasarımı ile 3 faktör ve 3 seviyeli olarak hazırlanmıştır. Çalışmada 3 bağımsız değişkenin 5 farklı özelliğe/yanıta etkisi incelenmiştir. Ph için seçilen değer aralığı 3.0-5.0, % ekstraksiyon oranı için seçilen aralık 0,2-1,0 ve kaplama materyali olaran seçilen farklı formüllerde kullanılan peynir altı suyu proteini oranı % 0-20 olarak belirlenmiştir. Bu amaçla, enkapsülasyon verimliliği, toplam flavanoid miktarı, toplam antioksidan miktarı, partükül boyutu ve zeta potansiyeli analizleri uygulanmıştır. Toplam antioksidan analizleri yapılırken, antioksidan özelliğinin farklı bileşenler tarafından oluşmasından dolayı tek bir analiz yeterli görülmemiş ve iki farklı metodla belirlenmiştir. Antioksidan kapasitesi DPPH (Diphenyl-1pictylhydrazyl) metoduyla serbest radikal yakalam özelliği ve CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity) metodu ile bakır iyonlarının indirgeme özelliği analizlenmiştir. Bu çalışmada kara havuç kimyasal yöntemler ile ekstraksiyon edildikten sonra dondurucu kurutucuda kurutulmuştur. Enkapsülasyon işlemine hazır olan ekstraktlar, maltodekstrin, gam arabik ve formülasyona uygun whey protein çözeltileri (%10) ile karıştırılmış sonrasında homojinasyon ve partükül boyutu küçültme amaçlı Ultratrox ve Ultrasound cihazlarında muamele görmüştür. pH ayarlamaları HCl ve NaOH çözeltileri ile yapıldıktan sonra partikül boyutları ve zeta potansiyelleri anında ölçülüp sonrasında püskürtmeli kurutucuda kurutulmuştur. RSM desenine göre aynı prosedür 15 farklı formülasyona uygulanmıştır. Sonrasında tüm analizler her örnek için tekrarlı uygulanmıştır. Analiz sonuçlarına göre en düşük enkapsülasyon verimi %60 iken en yüksek enkapsülasyon verimi %89,36 bulunmuştur. Toplam antioksidan aktivitesini belirlemek amaciyla yapılan analizlerden DPPH analizi sonuçları 21,09 mg Trolox/100 mg `dan 68,09 mg Trolox/100 mg`a kadar, CUPRAC analiz sonuçları ise 27,50 mg Trolox/100 mg`dan 141,58 mg Trolox/100 mg`a kadar değişmektedir. Toplam flavanoid miktarı analiz sonuçları ise 2,51 mg Trolox/100 mg`dan 9,54 mg Trolox/100 mg`a kadar değişmektedir. Enkapsülasyon verimine kaplama materyali ve kaplama materyali*ph interaksiyonunun önemli derecede (p<0,05) etkisi olduğu bulunmuştur. Antioksidan aktivetisinin bellirlenmesi için yapılan analizlerden birincisi olan DPPH analizinde konsantrasyonun etkisi p<0,05 öneminde etkisi olduğu belirlenmiştir, ikinci antioksidan belirlenme analizi olan CUPRAC için ise kaplama materyalinin p<0,01 öneminde etkisi olduğu tespit edilmiştir. Flavanoid miktarının belirlenmesi için yapılan analizde ise ph etkisi p<0,05 derecesinde önemlidir. Partikül boyutu ve zeta potansiyeli üzerine bağımsız değişkenlerin etkileri incelendiğinde ise p<0,005 derecesinde kaplama materyalinin önemi belirlenmiştir. Peynir altı suyu proteinin kaplama materyali içeresindeki oranı arttıkça zeta potansiyeli küçülmüş, partikül boyutu büyümüştür. RSM deseni sonucunda istenilirlik derecesinin 0,84 olduğu optimizasyon elde edilmiştir. Bu değer, analizlerin istenilebilir oranda tekrar edilip istenilen optimum koşulların elde edilebileceğini göstermektedir. Tahmin edilen değerler, gerçek değerlerle kıyaslanmıştır ve hata payının %5'den daha küçük olduğu tespit edilmiştir. Optimum koşullarda üretilen koaservatlar farklı gıda matrislerin etkisinin incelenmesi amacıyla çeşitli ürünlerde mide ve bağırsak sindirimleri incelenmiştir. Protein zengini ve karbonhidrat zengini matrislerin etkisini belirlemek amacıyla yağsız süt ve elma suyu numunelerine fenolik zengini kapsüller ilave edilmiştir. Ayrıca, sıcaklığın kapsüllerin stabilitesi üzerine etkisini inceleyebilmek için çikolatalı içecek tozuna kapsüller eklenmiştir ve hazırlama talimatlarına göre yarım yağlı süt ile sıcak (85oC) ve soğuk (4oC) olarak hazırlanmıştır. Kapsüller ile zenginleştirilen farklı gıdalar daha sonra biyoyararlılık çalışması için in vitro analiz edilmiştir. Çalışmalar mide ve bağırsak ortamında gerçekleştirilip, mide ortamını taklit eden sıvıya (SGF) ve bağırsak ortamını taklit eden sıvıya (SIF) salınan fenolik maddelerin toplam fenolik ve antioksidan aktivitesinin spektrofotometrik yöntemlerle analizleri yapılmıştır. SGF ve SIF salınımlarının örnekte bulunun gerçek toplam fenolik madde miktarına ve örneğin antioksidan aktivitesine kıyaslanabilmesi için biyoyararlılık analizi yapılmadan önce örneklerin bir miktarında kapsüller parçalanarak fenolik ekstraksiyonu yapılmıştır. Ayrıca kapsülsüz ürünlere de in vitro biyoyararlılık analizi yapılmıştır ve böylece kapsül ile zenginleştirilmiş ürünlerin sindirim sonucunda daha fazla antioksidan özellik gösterdiği bulunmuştur.