Synthesis of cationic antibacterial peptides

Vücuttaki bir doku hasar gördüğünde, hasara karşı vücudun biyolojik müdahalesi olan inflamasyonlar zarar görmüş bölgeyi düzeltmek için oluştulurlar. Dokular kimyasal bağlantılar tarafından rejenarasyona uğrarlar ve ardından düzeltme tamamlandıktan sonra inflamasyonlar kaldırılır. Doku hücreleri inflamasyonca zengin çevrede çoğalmaya devam ettiğinde, inflamasyon hücreleri tümör hücrelerine dönüşür. Tümor gelişimi ve inflamasyon arasındaki bu ilişki daha belirgin hale geldiğinden, inflamasyonu enfeksiyondan ayırt etmek kanserin erken teşhisinde çok önemlidir. Bu bağlamda, inflamasyonlar yerine sadece enfeksiyonlarda biriken katyonik antibakteriyel peptitler kullanışlı olabilirler. Kanserin erken evrelerinde tedavi veya tanı için kullanılan standart uygulama ise cerrahi müdahaledir. Tedavi yöntemlerinin sürekli gelişmesine rağmen sınırlı sayıda teşhis ajanı mevcuttur ve yeni ajanların geliştirilmesine ihtiyaç vardır. Erken tanı ve teşhisde kullanılabilecek yöntemlerden biri tümör mikroçevresinin etrafında oluşan proteinlerin biyobelirteçler olarak belirlenmesidir. Tümör oluşumu ve gelişimi sağlayan bu spesifik proteinler ve ligandları, tümör mikroçevresini oluşturdukları için biyobelirteç olarak seçilmektedirler. Günümüzdeki en son gelişmiş yöntem olan moleküler görüntüleme teknolojisi, bu biyobelirteçlere bağlanacak moleküler görüntüleme ajanlarının görüntülenmesinde kullanılabilmektedir. Bu tezin amacı, konvansiyonel PET ajanlarına alternatif olarak kullanılmak üzere tümör görüntülemesi için protein tabanlı peptidomimetiklerin ve enfeksiyon odaklarının hücresel ve moleküler düzeyde ayırt edilmesinde kullanılmak üzere peptitlerin geliştirilmesidir. Bu sebeple, tümörmikroçevresindeki immün ve stromal hücrelerinde bulunan biyobelirteçlere ve enfeksiyon hücrelerine yüksek bağlanma eğilimi ve seçicilikle bağlanabilen radyonüklidler ile işaretlenmiş peptidomimetikler ve peptitler tasarlanmış ve üretilmiştir. Öncelikli olarak sentezlenecek olan katyonik antibakteriyel peptit sekansları tasarlanmıştır. Bu peptitlerin toplam pozitif yük ve amfipatik özellik olmak üzere iki ana yapısal karakteristiği vardır. Katyonik yük pozitif yüklü amino asitlerle sağlanmaktadır. Bu sebeple peptit sekanlarına toplam yükü pozitif olan arjinin ve lisin aminoasitleri eklenmiştir. Antibakteriyel peptitlerin diğer anahtar özelliği ise, peptitlerin lipid yapılarına hızlı ve kolay bağlanmasını sağlayan amfipatik gruplardır. Pozitif yüklü peptitler ve negatif yüklü mikrobiyal hücre yüzeyleri arasındaki ilk etkileşim elektrostatik çekim kuvvetidir. Hayvan hücre zarlarının aksine, mikrobiyal hücre zarlarının yüzeyleri negatif yüklüdür. Bu sebeple antibakteriyel peptitler hayvan hücresindense bakteriye bağlanmayı tercih ederler. Mevcut farmasötikler yeterince hücreye özel olmadıklarından enfeksiyon ve inflamasyonları ayırt edememektedir. İnflamasyon belirtileri ve semptomları belirgin olmayan, çeşitlilik gösteren ve hatta belirlenemeyen özelliklere sahip olduğundan, ayırt edici ajanlar olarak antibakteriyel peptitler kullanılabilir. Antibakteriyel peptitler memeli hücreleri yerine tercihen bakterilere bağlanma özelliklerine sahiptir ve dokulara kolayca nüfuz edebilmektedirler. Birçok hastalığın tedavisinde erken teşhis önemli yer tuttuğundan katyonik antibakteriyel peptitler ayırt edici ajanlar ve görüntüleme ajanları olarak umut veren adaylardır. Bu bilgiler doğrulusunda tez kasamında yapılan çalışmalarla, tasarlanan birden fazla antibakteriyel peptit sekansı sentezlenmiş ve ardından antibakteriyel görüntüleme ajanı olan Rodamin B boyası eklenmiştir. Bu boya, amino asitlerin birbirlerine bağlanma mekanizmasıyla aynı yöntem kullanılarak peptit sekansına eklenmiştir. Yapılan deneyler sonucunda antibakteriyel peptit boya eşleşmesi başarıyla gerçekleştirilmiş ve peptitler RP-HPLC ile saflaştırılmıştır. Ardından analiz sonuçların doğruluğu kütle spektrometresiyle kanıtlanmıştır. Rodamin B'nin floresan özelliği sayesinde izlenebilir hale getiren peptitler, ileriki çalışmalarda kararlılık, bağlama eğilimi ve stabilite analizleri için kullanılacaktır. Katyonik antibakteriyel peptit çalışmalarına ek olarak, tümor hücrelerine bağlanmak üzere organik tabanlı peptidomimetikler üzerinde çalışılmıştır. Peptidomimetik yapısının çeşitli parçaları olan organik moleküller tasarlanmış, sentezlenmiş, saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Bu çalışmalar boyunca üretilen peptidomimetikler farmakofor yaklaşımı ile tasarlanmıştır. Tasarlama prosesi boyunca, ligand-protein bağlanma etkileşimini engellemeyecek optimal kısımlar herbir farklı molekül için belirlenmiştir. Tasarlanan bu moleküller arasından sentezlenebilir olmayanlar elenmiştir. Molekülün ana gövdesine karar verildikten sonra, farmakofor yaklaşımla molekül yapısı geliştirilmeye devam edilmiştir. Ana gövde tasarım kolaylığı ve sentez metodu sebebiyle üç parçaya bölünmüştür. Her bir parça çeşitli gruplarla türevlendirilerek molekül tasarımına eklenmiştir. Tez çalışmaları kapsamında gerekli parçaların tasarımları, sentezleri ve saflaştırmaları optimize edilmiştir. Sentezlenen parçalar gerekli teknikler kullanılarak saflaştırılmıştır. Ardından 1H-NMR kullanılarak karakterizasyonları gerçekleştirilmiş ve sentezlerin doğruluğu onaylanmıştır. Bu çalışmalar tamamlandıktan sonra, bireysel parçalar tüm bir peptidomimetiği elde etmek üzere birleştirilecektir. Öncelikli olarak floresan boya ile işaretlenen bu peptitlerin ortogonal şekilde türevlendirilerek çeşitlendirilmesi amaçlanmaktadır. Peptidomimetik parçaları üzerinde ortogonal koruma gerçekleştirilerek DOTA-şelatlarının gerekli etkileşimleri engellemeyeck şekilde bağlanması tasarlanmıştır. Radyofarmasötik alanda PET-BT cihazları için en yaygın olarak kullanılan aktif izotop Ga68 'dir. DOTA şelatı Ga68'e uygun oyuk çapı sebebiyle seçilmiştir ve peptidomimetiklerin elverişli bölgelerine eklenecektir. Laboratuvar çalışmaları tamamlandıktan sonra biyobelirteçlere bağlanma eğilimi ve stabilite analizleri yapılacaktır. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlara göre, yüksek bağlanma eğilimi ve seçicilik performanslarını geliştirmek için çeşitli modifikasyonlar ve değişiklikler uygulanacaktır. Peptitlerin kararlılığını arttırmak üzere L ve D konformasyonları arasındaki stabilite farklılıklarından yararlanılacaktır. Peptidomimetiklerde ise sanal tarama yöntemi kullanılarak olası aktif moleküller belirlenecektir. Pozitron emisyon tomografisi-bilgisayarlı tomografi (PET-BT), günümüzde çoğunlukla kullanılan en gelişmiş teknolojilerdendir. PET-BT sadece anatomik bilgi değil aynı zamanda doku ve organların metabolik ve fonksiyonel durumu hakkında da bilgi vererek onkolojik görüntüleme için kullanılmaktadır. Bu sebeple, biyolojik olarak aktif olduğu tespit edilen bileşikler tanımlandıktan sonra bu bileşikler PET-BT cihazlarında görüntüleme amacıyla kullanılmak üzere Ga68 ve DOTA-şelatları ile radyolojik olarak işaretleneceklerdir.