Formation of epoxy fatty acids during autoxidation of linseed, sunflower and olive oil

Yağlar, vücutta önemli enerji ve depo kaynağı olmaları sebebiyle kilit bir role sahiptir. Ancak ışık, sıcaklık ve oksijen gibi faktörler sebebiyle oksidasyon reaksiyonları başlayabilmektedir. Oksidasyon reaksiyonları sonucunda oluşan bileşenler, tat ve kokuda bozukluk ile besin değerinin azalmasının yanı sıra toksiksisite sebebi olabilmektedir. Mekanizmalarına göre oksidasyon reaksiyonları; otooksidasyon, termooksidasyon, fotooksidasyon ve enzimatik oksidasyon olmak üzere 4 çeşittir. Bu çalışmanın temel aldığı otooksidasyon, oda sıcaklığında serbest radikal zincir reaksiyonuna dayalı oksidasyon çeşididir. Başlangıç, yayılma ve terminasyon olmak üzere üç aşamada gerçekleşmektedir. Başlangıç aşamasında, katalizör varlığında doymamış yağ asitlerinden hidrojen ayrılmasıyla serbest radikaller oluşmakta, yayılma aşamasında ise oluşan bu serbest radikaller ile moleküler oksijen reaksiyona geçerek hidrokperoksitler oluşmaktadır. Ortamda hidroperoksitlerin birikmesi, birbirleriyle reaksiyona girmelerine ve böylelikle radikal olmayan bileşenlerin oluşmasıyla sonuçlanır. Bu aşama terminasyon olarak adlandırılmaktadır. Fotooksidasyon, ışık, ve klorofil gibi ışığa duyarlı bileşenler varlığında karasız oksijen ile gerçekleşen oksidasyon reaksiyonudur. Kararsız oksijen, moleküler oksijene göre daha reaktif bir bileşen olduğundan fotooksidasyon reaksiyonları otooksidasyon reaksiyonlarından daha hızlı gerçekleşmektedir. Termooksidasyon, yüksek sıcaklıklarda otooksidasyon mekanizmasına benzer şekilde gerçekleşir ancak bu tip oksidasyonda sıcaklığa bağlı reaksiyonlar ve oksidasyon eş zamanlı gerçekleşmektedir. Enzimatik oksidasyon, işlenmemiş gıdalarda lipoksigenaz enzimi tarafından katalizlenmekte olup, yemeklik yağlarda meydana gelmez. Oksidasyonu etkileyen temel faktörler; ışık, sıcaklık, oksijen, yağ asidi komposizyonu ve yağın içerisinde eser miktarda bulunan bileşenlerdir. Işık; klorofil ve benzeri ışığa duyarlı molekülleri aktive ederek moleküler oksijenin daha aktif kararsız oksijene dönüştürülerek fotooksidasyon reaksiyonlarının başlaması sağlamaktadır. Otooksidasyon ve hidroperoksit bozunması sırasında ise hidrojen ayrılmasını sağlamaktadır. Sıcaklık ile oksidasyon hızı doğru orantılı olarak artmaktadır. Yağın doymamışlık oranı arttıkça oksidasyon hızı da artmaktadır. Ayrıca, yağın içerisinde bulunan antioksidanlar, metaller ve ışığa duyarlı moleküller de az miktarda bulunmalarına rağmen oksidasyon hızını etkileyen önemli parametrelerdir. Antioksidanlar, çeşitlerine göre farklı mekanizmalarla oksidasyonun önlenmesini sağlarlar. Bitkisel yağlarda yüksek miktarlarda bulunan klorofil pigmenti, oksijen ve ışık varlığında fotooksidasyonu hızlandırırken, karanlıkta antioksidan olarak etki etmektedir. Metaller ise otooksidasyonun başlangıç aşamasında ve hidroperoksitlerin diğer kimyasal bileşiklere bozunmasında etkilidirler. Birincil oksidasyon ürünleri olan hidroperoksitler, açil karbonlardaki hidrojenin ayrılmasıyla oluşmaktadır. Oleik asit, linoleik asit ve linolenik asit içeren yağlarda açil karbon sayısına bağlı olarak farklı kimyasal yapıda konjuge hidroperoksitler oluşmaktadır. Linolenik asitte daha fazla açil karbon olması sebebiyle, otooksidasyon oleik asite göre 250 kat hızlı gerçekleşmekte ve daha fazla miktarda peroksit oluşumu gözlenmektedir. Birincil oksidasyon ürünleri olan hidroperoksitlerin bozunması ile ikincil oksidasyon ürünleri oluşmaktadır. Okside olmuş monomerler, aldehitler, ketonlar ve polimerik bileşikler bunların bir kısmıdır. Epoksi yağ asitleri, 3 atomlu halkalı yapıya sahip okside olmuş monomerlerdir. Bilinen oluşum mekanizmaları peroksi radikallerin, hidroperoksitlerdeki çift bağa katılımı şeklindedir. Epoksi yağ asitleri ile ilgili literatürde kısıtlı bilgi bulunması sebebiyle bu çalışmada, çeşitli bitkisel yağlarda otooksidasyon reaksiyonları sonucunda oluşan epoksi yağ asitlerinin incelenmesi hedef alınmıştır. Deney modellemesi yapılırken, oksidasyonu etkileyen iki temel parametre baz alınmıştır; yağ asidi kompozisyonu ve klorofil içeriği. Yağ asidi kompozisyonundaki farklılıkların etkisini gözlemlemek amacıyla, farklı doymuşluk oranına sahip içersinde bulunan tüm bileşenlerinden ayrılmış üç çeşit yağ kullanılmıştır; zeytinyağı (C18:3), ayçiçek yağı (C18:2) ve keten tohumu yağı (C18:1). Klorofil içeriğinin etkisi ise, kontrol ve deney grupları oluşturularak belirlenmiştir. Deney grupları her üç çeşit yağın sızma zeytinyağı ile sırasıyla 2:1 oranında karıştırılmasıyle oluşturulmuştur. Kontrol grupları ise her yağ çeşidinin, içersindeki tüm bileşenlerden arındırılmış zeytinyağı ile deney gruplarındaki oranla aynı olacak şekilde karıştırılmasıyla elde edilmiştir. Modeller hazırlandıktan sonra, örnekler 1, 4, 7, 14, 21, 28, 42 ve 56 günlerde analiz edilmek üzere inkübasyona bırakılmıştır. Otooksidasyon koşullarının sağlanması için örnekler karanlıkta bekletilmiş, tüplerin kapağı oksijen geçişini sağlamak için pamuk ile kapatılmıştır. Epoksi yağ asitleri GC-FID'de polar CP-Sil 88 kolon kullanılarak nicel ve nitel olarak tanımlanmıştır. Sonuçlar 'SPSS Statistics 22' kullanılarak tek yollu ANOVA ile değerlendirilmiştir. Oksidasyonun göstergeleri olması sebebiyle peroksit değeri, konjuge dien ve trien ile p-anisidin analizleri de yapılmıştır. Epoksi yağ asitleri oluşumunun herhangi biriyle ilişkili olup olmadığını gözlemlemek amacıya Pearson korelasyonu uygulanmıştır. Ayrıca ana parametreler olan klorofil içeriği ve yağ asidi komposizyonu (GC-FID ile) da analizlenmiştir. Sızma zeytinyağı kullanılan karışımlarda klorofil miktarı ortalama olarak 6.8 mg/kg olarak hesaplanmıştır. Bu değerde, örneklerin karanlıkta bekletilmeleri sebebiyle 56 günlük inkübasyon süresi sonunda önemli miktarda bir azalış gözlenmemiştir. Zeytinyağının içerisindeki klorofil dahil bütün minor bileşenlerin uzaklaştırıldığı kontrol gruplarında ise klorofil miktarı 0 mg/kg olarak saptanmıştır. Bu durumda, sadece klorofil miktarı baz alındığında, sızma zeytinyağı kullanılan örneklerde bulunan klorofilin antioksidan olarak etki göstermesi ve oksidasyonun diğer modele göre daha yavaş gerçekleşmesi beklenmektedir. Yağ asidi kompozisyonları karşılaştırıldığında, literatürde belirtildiği gibi keten tohumu yağı örneklerinin linolenik asitce, ayçiçek yağı örneklerinin linoleik asitce ve zeytinyağı örneklerinin oleik asitçe zengin olduğu GC-FID ile yapılan analizde bir kez daha kanıtlanmıştır. Bütün gruplar, zeytinyağı ile karıştırıldığı için önemli miktarlarda oleik asit her örnekte mevcuttur. Dolayısıyla, sadece yağ asidi kompozisyonu karşılaştırıldığında oksidasyona en hassas örnek grubu keten tohumu yağı içeren grup olarak belirlenmiştir. Oksidatif stabilite ve birincil oksidasyon ürünlerinin oluşumunu gösteren peroksit değeri inkübasyon süresi boyunca, 1 meq O2/kg yağ değerinden genel olarak bütün gruplarda düşük olduğundan, oksidasyon hızının yavaş olduğu görülmektedir. Sadece, klorofil içermeyen keten tohumu yağı örneklerinde 42. günden itibaren bu değerin üzerinde peroksit değeri gözlense de, örneklerin çok fazla okside olduğu söylenememektedir. Konjuge dien ve trienler hidroperoksitler ile çok yakın yapıda olduklarından, benzer trend göstermişlerdir. İkincil uçucu oksidasyon ürünlerinin oluşumunu belirten p-anisidin değeri ise inkübasyon süresi boyunca dalgalı bir trend göstermiştir. Epoksi yağ asitleri oluşumu en fazla miktarda yapısında üç çift bağ bulunduran keten tohumu yağında gözlenmiştir. Ancak klorofil pigmenti içermeyen ayçiçek yağı karışımı ve zeytinyağı karışımı örneklerinde 56 gün sonunda epoksi yağ asidi oluşumu gözlenmemiştir. Deney modellemesine bağlı olarak, klorofil içeren örneklerde oksidasyonun daha hızlı olacağı öngörülmüştü. Tam tersi durumun oluşmasının sebebi, klorofil içermeyen kontrol grubu örneklerinin aynı zamanda oksidasyonu hızlandırıcı etkisi olan metal gibi eser miktarda bulunan bileşenleri de içermemesi olarak görülmektedir. Bu durumun diğer bir sonucu keten tohumu modelleri karşılaştırıldığında da anlaşılmaktadır. Sızma zeytinyağı ile karıştırılan yağ örneklerinde epoksi yağ aside oluşumu metal içeriğine bağlı olarak hemen başlarken, diğer grupta oluşumun daha geç ancak daha hızlı meydana gelmesidir. Ancak yalnızca 56 gün inkübasyon sonundaki sonuçlara bakılacak olursa, ayçiçeği ve zeytinyağı gruplarından farklı olarak, kontrol grubunda yaklaşık 5 kat fazla epoksi yağ aside formasyonu görülmüştür. Cis ve trans isomere sahip 11 çeşit epoksi yağ asidi tanımlanmıştır. Sızma zeytinyağı içeren modeldeki örneklerde cis yapısı daha fazla miktarda oluşurken, diğer modelde trans epoksi yağ asidi oluşumu baskın olarak görülmektedir. Epoksi yağ asitleri oluşumu ile p-anisidin değerleri arasında korelasyon bulunanamamıştır. Peroksit değeri ile epoksi yağ asitleri arasında ise sadece keten tohumu yağı kullanılan modellerde güçlü bir korelasyon bulunmuştur. Epoksi yağ asitlerinin hidroperoksitlerin bozunmasıyla oluşan bileşenler olduğu literatürde belirtildiğinden, oluşan peroksit miktarı ile epoksi yağ aside miktarı karşılaştırılmıştır ve şaşırtıcı olarak epoksilerin peroksitlerden çok daha fazla miktarda oluştuğu görülmüştür. Benzer düşünceyle, peroksitler ile konjuge dien ve trien yapısı arasındaki ilişki Pearson korelasyonu kullanılarak kanıtlanmıştır. Sonuç olarak, epoksi yağ asitlerinin oksidasyon çok hızlı olmadığı zaman bile yüksek miktarlarda oluştuğu bu çalışmada görülmüştür. Oluşum mekanizmalarının net olarak anlaşılması ve bu konuda yapılan çalışmaların arttırılması, cevabı şu an için kesin olmayan bir çok soruya ışık tutması açısından önem teşkil etmektedir.