Klinik Pseudomonas aeruginosa izolatlarında β-laktamaz direnç genlerinin taranması ve yeni bir metallo-β-laktamazın (VIM-38) karakterizasyonu

Bu doktora tezinde, 104 P. aeruginosa suşu çalışılmıştır.Antibiyogram sonucuna göre izolatlardan 24 tanesinin çoklu ilaç-dirençli olduğu belirlendi. Tüm izolatlarda beta-laktam direnç genlerinin varlığı PZR yöntemiyle değerlendirildi ve 104 örnekten birinin GES diğerinin ise VIM pozitif olduğu tespit edildi. DNA dizi analizine göre, GES'in %100 GES-5'e, VIM tipi MBL'in ise bir aminoasit farkla (Ala265Val) %99 VIM-5'e benzediği belirlendi. Bu yeni varyant VIM-38 olarak adlandırıldı ve nükleotid sırası GenBank'a giriş yapılarak kayıt numarası alındı (Kayıt No: KC469971). blaVIM-38 pET-28a ekspresyon vektörüne klonlanarak Ni-afinite ve jel filtrasyon kromotografisi ile saflaştırıldı. Kütle spektrometresi kullanılarak VIM-5 ve VIM-38'in kütleleri belirlendi ve proteinlerin bir veya iki çinko iyonu içerdikleri doğrulandı. Aynı deneysel koşullar altında VIM-1, VIM-2 ve VIM-5 enzimleri ile karşılaştırmalı olarak VIM-38 enziminin detaylı kinetik ve biyokimyasal karakterizasyonu yapıldı. Genel olarak, VIM varyantları test edilen β-laktam substratlara karşı katalitik etkinliklerinde çok az farklılıklar görüldü. Sefalothin ve nitrosefin tüm VIM varyantları tarafından eşit hidroliz edildi. Sefoksitin için VIM-2, VIM-5 ve VIM-38 ile VIM-1 karşılaştırıldığı zaman VIM-1 çok düşük kcat/Km değerine sahiptir ve aralarında yaklaşık 6 kat fark vardır. VIM-38 VIM-5 enzimi ile karşılaştırıldığı zaman seftazidim için yaklaşık 10 kat düşükkcat/Km değerine sahip olduğu belirlendi. VIM varyantları üzerine triptofan türevleri ile yapılan inhibisyon araştırmasında özellikle VIM-5 ve VIM-38 enzimlerinin en düşük %KA sahip olduğu görüldü. Test edilen inhibitörler tarafından VIM-1 hiç inhibe olmazken VIM-2'nin zayıf bir şekilde inhibe edildi. Enzimlerin çok yakın CD spektrasına ve sekonder yapıya sahip oldukları belirlendi. VIM-5 ve VIM-38 enzimleri VIM-1 ve VIM-2 ile karşılatırıldıkları zaman çok daha kararlı oldukları tespit edildi.