Konkanavalin a baskılanmış yüzey plazmon rezonans temelli biyosensörün hazırlanması

Bu tez kapsamında, Konkanavalin A tayini için Konkanavalin A baskılanmış yüzey plazmon rezonans (SPR) biyosensörler hazırlanmıştır. Bu amaçla, ilk olarak SPR biyosensör çip yüzeyi allil merkaptan ile modifiye edilmiştir. Daha sonra N-metakriloil-(L)-histidin metil ester (MAH) monomeri kullanılarak Konkanavalin A kalıp molekülü ile birlikte farklı molar oranlarında ön polimerizasyon kompleksleri oluşturulmuştur. Ön kompleks, fonksiyonel monomer olarak kullanılan HEMA, çapraz bağlayıcı olarak kullanılan EGDMA ile oluşturulan polimer karışımı içerisine katılmış ve AIBN başlatıcısı varlığında SPR çip yüzeyinde UV ışığı kullanılarak polimerleştirilmiştir. Kontrol grubu olarak Konkanavalin A kalıp molekülü kullanılmadan aynı işlemler gerçekleştirilmiş ve Konkanavalin A baskılanmamış SPR biyosensörler hazırlanmıştır. Hazırlanan SPR çipler atomik kuvvet mikroskobu (AFM), elipsometre ve temas açısı ölçümleri ile karakterize edilmiştir. Konkanavalin A molekülü için uygun pH değerinin belirlenmesi amacı ile Konkanavalin A baskılanmış biyosensör ile pH 4, 5, 6, ve 7.4 fosfat tamponları ile hazırlanmış Konkanavalin A çözeltileri kullanılarak pH taraması gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sensorgramlar ile Konkanavalin A molekülü için uygun pH değeri 7.4 fosfat tamponu olarak tespit edilmiştir. Daha sonra farklı derişimlerdeki Konkanavalin A çözeltileri (0.01-50 ng/mL) ile kinetik analiz yapılarak SPR biyosensörün ölçüm hassasiyeti belirlenmiştir. Ölçüm sonuçlarından elde edilen sensorgramlar sonucunda hazırlanan baskılanmış biyosensörün doğruluğu (0.01-5 ng/mL) derişim aralığında %99; (10-50 ng/ml) aralığında ise %96 doğrulukta ölçüm yapmaktadır. Tayin limiti (LOD) 0.0011 ng/mL ve tayin sınırı (LOQ) 0.0038 ng/mL olduğu hesaplanmıştır. Farklı derişimlerde hazırlanmış Konkanavalin A çözeltileri bağlanma kinetiğinin belirlenmesi amacı ile kullanmıştır. Hazırlanmış olan biyosensör için en uygun adsorpsiyon modeli Langmuir olarak tespit edilmiştir. Seçicilik çalışmaları, Konkanavalin A baskılanmış ve baskılanmamış SPR biyosensörler ile moleküler yapı bakımından benzer olan sığır serum albumin (BSA) ve miyoglobin (Myg) yarışmacı molekülleri ile gerçekleştirilmiştir. Gerçek örnek çalışmaları için soya fasulyesinden Konkanavalin A molekülü saflaştırılmıştır. Gerçek örnekten hazırlanan örneklerin Konkanavalin A baskılanmış SPR biyosensör ile kinetik analizleri gerçekleştirilmiş ve elde edilen sensorgramlar ile Konkanavalin A miktarı ve geri kazanım hesaplanmıştır. Konkanavalin A molekülünün yapay kontrol plazma ortamındaki uygunluğunu belirlemek amacıyla yapay kontrol plazma içerisinde farklı derişimlerde hazırlanmış Konkanavalin A çözeltilerinin baskılanmış SPR biyosensör ile kinetik analizleri gerçekleştirilmiş, elde edilen sensorgramlar ile Konkanavalin A miktarı ve geri kazanım hesaplanmıştır. Konkanavalin A molekülünün tekrar kullanılabilirliğinin incelenmesi amacıyla aynı gün içerisinde peş peşe 4 tekrarlı analizler gerçekleştirilmiştir. Ayrıca farklı zamanlardaki biyosensör kullanılabilirliğini test etmek amacıyla 1., 2., 4. ve 6. aylarda kinetik analizler gerçekleştirilmiştir. Hazırlanan Konkanavalin A baskılanmış SPR biyosensörün Konkanavalin A tayini için hassas, hızlı, uzun ömürlü ve maliyetli bir teknik olduğu gösterilmiştir.