Kütle spektrometrisi uygulamalarında fosfopeptitlerin hassas tayini için yeni stratejilerin geliştirilmesi

Proteinlerin çoğu belli bir zamanda, belli bir fonksiyonu yerine getirirken serin, treonin veya tirozin aminoasitleri üzeriden fosfatlanmış olabilirler. Yapısında fosfat grubu bulunduran proteinlere fosfoprotein; fosfat grubunun bulunduğu daha küçük aminoasit dizilerine fosfopeptit denilmektedir. Hayati önem taşıyan birçok biyolojik fonksiyon, proteinlerin fosforolizasyonu ve defosforilizasyonu gibi post translasyonel modifikasyonlar (post translational modifications, PTMs) ile açıklanabilmektedir. Serin (Ser), treonin (Thr) ve tirozin (Tyr) aminoasitlerinin hidroksil gruplarında meydana gelen bu modifikasyonlar esnasında, kinaz enzimleri aminoasitlere fosfat grupları bağlarken, fosfataz enzimleri ise fosfat gruplarını kesmektedir. Birçok post-translasyonel modifikasyonun hücresel aktivite, tepki verme ve gelişim mekanizmalarındaki rolleri, hala tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu yüzden post-translasyonel modifikasyonları incelemek ve mekanizmalarını aydınlatmak önemlidir. Bu tez kapsamında, insan vücudunda bulunan demir ve kalsiyumun kullanım oranını arttırırken, yağ asitlerinin yıkımını engelleyen fosfopeptitlere karşı ilgi (afinite) gösterdiği bilinen organik ve/veya anorganik moleküller içeren malzemeler üretilerek, fosfopeptitlerin zenginleştirilmesi sağlanmış ve sonrasında ESI (electrospray ionization) kütle spektrometrisi yöntemi ile etkin bir şekilde incelenmiştir. Sol-jel malzemeler ağırlıklı olarak C6H6MgO7 (Magnezyum sitrat) tuzu ile TEOS (tetraetilortosilikat) kimyasal bileşenleri kullanarak sentezlenmiştir. Magnezyum elementi metabolizma içerisinde en fazla bulunan dördüncü mineral olarak, vücut içerisinde 300 farklı tepkimede rol oynamaktadır. Protein sentezi gibi faaliyetlerdeki görevlerine ek olarak Pearson'ın sert-yumuşak asit ve bazlar teorisine göre sert bir asit olan Mg2+ katyonunun, sert bir baz olan PO-4 anyonuyla daha kuvvetli etkileşime girmesi beklenmektedir. Bu nedenle magnezyum iyonu içeren farklı tipte sol-jel malzemeler sentezlenmiştir. Üretilen malzemelerden H3PO4 (fosforik asit) katılarak sentezlenen C6H6MgO7-H3PO4@TEOS sol-jelinin fosfopeptit zenginleştirme çalışmalarında en yüksek performansı gösterdiği görülmüştür. ATR-FTIR (Attenuated Total Reflection-Fourier Transform Infrared) spektroskopisi ve TGA (Thermo Gravimetric Analysis) ile gerçekleştirilen karakterizasyon çalışmalarında C6H6MgO7-H3PO4@TEOS sol-jel yapısının diğer sol-jel yapılarına göre daha çok su barındırdığı ve bu sayede çözeltideki fosfopeptitlerin sol-jel yapısına difüzyonunu hızlandırarak adsorpsiyon kapasitesini artırdığı anlaşılmıştır. Bu sayede 13 pmol/mL (13 fmol/µL) derişime sahip fosfopeptitler başarılı bir şekilde zenginleştirilmiştir. Sol-jel malzemelerin yüzeylerinde XPS (X-Ray Photoelectron Spectroscopy) ile gerçekleştirilen analizlerde, sentez esnasında malzemeye eklenen kimyasallardan TEOS (tetraetilortosilikat) ve fosforik asit ile fosfopeptitlerin başarılı bir şekilde zenginleştirilmesinde etkili olan C6H6MgO7 maddelerinin yapıda bulundukları gözlenmiştir. Zenginleştirme çalışmaları sonucunda elde edilen ESI kütle spektrumları açık kaynak kodlu mMass yazılımı (www.mmass.org) kullanılarak incelenmiş, fosfopeptit yakalama oranları matematiksel ve bilimsel olarak ortaya konulmuştur.