Macrovipera lebetinus zehrinin insan kolorektal karsinom hücreleri üzerinde moleküler ve terapötik etkisinin araştırılması

Kanser, çevresel veya kalıtsal bir şekilde kişinin vücudunda oluşarak anormal hücrelerin çoğalmasını, farklılaşmasını ve ölümünü kontrol altına alan genlerin hastalığıdır. Kalın bağırsak dokusunda oluşan kolorektal kanser (KRK) tedavisi için günümüzde kullanılan geleneksel tedavi yöntemleri, hastaların vücudunda sağlıklı hücrelere de zarar vererek kişinin bağışıklığını düşürür. Düşük bağışıklık sistemine sahip olan hastalar için KRK tedavisi yetersiz kalmakta ve çeşitli yan etkiler göstermesiyle de tedavide umut verici olmamaktadır. Bilim insanları, mutasyonlu KRAS, BRAF, FAS ve TRAIL genlerinin olması ile tedavilere direnç gösteren kolon tümörlerine karşı doğal bir şekilde üretilen ve sağlıklı hücrelere zarar vermeyip tümör hücrelerine karşı sitotoksik özellik gösteren alternatif veya tamamlayıcı tedavi yöntemlerini geliştirmeyi amaçlamıştır. Yapılan araştırmalar doğrultusunda yeni tedavi yöntemleri için karmaşık yapılı yılan zehirlerinin içerisinde metal iyonlarının ve peptit içerikli fosfolipaz A2 (PLA2), metalloproteinaz (SVMP), serinproteinaz (SVSP) ve L- amino oksidaz (LAAO) gibi maddelerinin varlığı terapötik etkisinin güçlü bir potansiyel olabileceğine dikkat çekmektedir. Özellikle çeşitli kanser türlerine karşı yapılan araştırmalar Elapidae ve Viperidae familyasına ait yılan zehirlerinin tümör hücreleri üzerinde ROS salınımını aktive etme, apoptoz mekanizmasını başlatma, integrin aktivitesini engelleme ile metastaz ve koloni oluşumunu yok etme gibi etkiler göstererek kanser tedavisi için umut verici olmaktadırlar. Bu tez çalışmasında Ülkemizde bulunan Viperidae familyasına ait Macrovipera lebetinus yılan zehrinin kolorektal karsinom hücreleri üzerindeki moleküler ve terapötik etkileri araştırılmıştır. Şanlıurfa ilinin Soğmatar köyünden toplanan koca engerek yılanı parafilmle kapatılmış steril bir toplama kabına ısırtıldı ve zehir bezleri sıkıştırılarak sağım işlemi yapıldı. Yılan zehrinin sağım işleminden sonra zehrin gücünü ve stabilitesini korumak için liyofilizasyon işlemi yapılarak toz haline getirildi. Toz halinde olan ham Macrovipera lebetinus yılan zehrinin zengin peptit ve protein içeriği SDS-PAGE yöntemi, RP-HPLC kromatografisi yöntemi, pH analizi, bisinkoninik asit (BCA) total protein miktar tayini, UV-Vis ve FT-IR spektroskopik yöntemleri ile karakterize edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Macrovipera lebetinus, Kolon kanseri, Sitotoksisite, Apoptoz, Gen ve protein ekspresyonu, Yılan zehri Ham koca engerek yılan zehrinin sitotoksisite analizi insan kolon adenokarsinom DLD-1 ve insan sağlıklı kolon CCD-18Co hücre hatları üzerinde Alamar Blue yöntemi ile in vitro koşullarda belirlendi. Ham Macrovipera lebetinus yılan zehrinin DLD-1 hücre hattında yarısını öldüren doz (IC50) hesaplandıktan sonra in vitro koşullarda apoptotik etkisi, metastaz ve koloni oluşumu kapasitesi araştırıldı. Ham Macrovipera lebetinus zehrinin DLD-1 hücre hattında moleküler düzeydeki etkilerini değerlendirmek için Western Blot ve qRT-PCR yöntemleri ile sırasıyla protein ekspresyonu ve gen ekspresyonu çalışmaları yapıldı. Tez çalışmasında elde edilen bulgular doğrultusunda zehrin karakterizasyon çalışmaları sonucunda peptit içerikli protein örnekleri SDS-PAGE yöntemi ile 15 belirgin literatür ile uyumlu protein fraksiyonu belirlenmiştir. Daha detaylı bir şekilde sitotoksik etkilerini araştırmak için peptit içerikli proteinlerin analizi RP-HPLC kromatografisi yöntemi ile 29 farklı fraksiyonun varlığı tespit edildi. Asidik özellik gösteren zehrimizin total protein miktarı 2538.75 μg/mL konsantrasyonda hesaplandı ve 280 nm'de maksimum absorpsiyonda floresans özellik gösterdi. Ham yılan zehrimizin biyomoleküler mekanizmasını aydınlatmak için FT-IR analizi sonucunda literatür ile uyumlu 11 farklı zirve titreşimlerinin varlığı ile peptit/protein yapılar, aminler, nükleozitler, karbonhidratlar ve inorganik elementlerden oluştuğu belirlendi. Ayrıca içerisinde zehir bezi lümenini saran ribonükleik asit (RNA) ve deoksiribonükleik asit (DNA) kalıntılarının varlığı da kanıtlandı. Yılan zehri muamele edilen insan adenokarsinom hücre hattı DLD-1 ve insan sağlıklı kolon CCD-18Co hücrelerinin canlılığında doza bağlı bir azalma olduğu ölçüm sonunda belirlendi. IC50 değerleri sırasıyla 6.12 μg/mL ve 15 μg/mL olarak hesaplandı. DLD-1 kolon kanseri hücre hattına kıyaslandığında sağlıklı insan kolon hücrelerinin çok düşük sitotoksik etkisi vardır. DLD-1 hücrelerini kontrol grubuna kıyasla migrasyon oranını %88.28 oranında, koloni oluşumunu ise %71.51 oranında (p<0.0001) inhibe etti. Apoptoz analizleri sonucunda erken apoptoz oranı %13.07 ve geç apoptoz oranı da %0.96 şeklinde DLD-1 hücrelerini apoptoza sürükledi. Zehir muamelesi ile DLD-1 hücre hattında insan apoptoz paneli gen çalışmasında 74 genin ekspresyonunu arttırdı ve 4 genin ekspresyonunu ise azalttı. Kontrol grubuna kıyasla DLD-1 hücre hattında insan kolon kanseri paneli gen çalışmasında 72 genin ekspresyonunu azalttı ve 1 genin ekspresyonunu ise arttırdı. Protein ekspresyonu çalışmalarında zehir kolon adenokarsinom hücre hattında BCL-2 (0.56-kat) protein ekspresyonunu azalttı, P53 (1.08-kat) ve BAX (1.25-kat) protein ekspresyonlarını ise arttırdı. Tez çalışmasındaki verilere göre kişide KRK oluşum sebebi çevresel faktörler veya kalıtsal faktörler sonucunda ise etkili gen ve protein mekanizmalarını arttıran yada azaltan yılan zehrimiz direnci azaltıcı özellik göstererek tedaviye yanıt verici bir ajan olduğu düşünülmektedir.