Mekanik olarak dayanıklı tek-, çift- ve üç-ağ yapılı fibroin kriyojellerinin sentezi ve karakterizasyonu

Doku mühendisliği, mühendislik ve doğa bilimlerinin prensiplerini kullanarak organ geliştirmeyi, bir dokunun işlevini arttırmayı ya da iyileştirmeyi amaçlayan bir bilim dalıdır. Doku mühendisliği disiplinlerarası bir dal olup sadece biyoloji ve medikal alanlarla ilgili değil; aynı zamanda kimya, kimya mühendisliği, biyomühendislik ve malzeme bilimleri gibi bilim dallarıyla da yakından ilişkilidir. Doku mühendisliği, klasik yöntemlerle tedavi edilemeyen hastalarda hasarlı dokuların yenilenmesi ve iyileştirilmesi için oldukça önemlidir. Doku mühendisliğinin en önemli uğraş alanlarından bir tanesi, hücrelerin biyolojik dokuyu oluşturabileceği, büyüyüp farklılaşabileceği, geçici bir kalıp görevi gören iskelet malzemeler geliştirmektir. Bu malzemeler, biyouyumlu ve biyobozunur olmalı, gözenekli bir üç boyut mimarisine sahip olmalı ve aynı zamanda geliştirilecek dokuya uygun mekanik özelliklere sahip olmalıdır. Doğal malzemeler, biyolojik yapılarından dolayı biyouyumluluğu ve hücrelerle etkileşimi daha iyi olduğundan doku mühendisliğinde biyomalzeme olarak kullanılabilirler. Buna en uygun örneklerden bir tanesi ipektir. İpek, ipek böceği ve bazı örümcek türleri tarafından epitel hücreler içinde sentezlenen bir biyopolimerdir. İpeğin yapısında büyük oranda fibroin bulunmaktadır. Fibroin, ağırlıklı olarak glisin ve alanin aminoasitlerinden oluşan, büyük hidrofobik bloklar ve bu blokların arasında ve zincir uçlarındaki hidrofilik bloklardan oluşan bir kopolimerdir. Hidrofobik kısımlar arası asosiyasyonlar fibroinin rastgele yumak yapısından β-tabaka yapısına geçmesine neden olur. Fibroinin jelleşmesinin temeli de hidrofobik kısımlar arasında meydana gelen bu β-tabaka yapılarıdır. β-tabakalar malzemeye dayanıklılık ve sertlik kazandırır. Diğer yandan hidrofilik kısımlar ise suda çözünmeyi sağlar. Ayrıca tokluğu ve elastisiteyi arttırır. Fibroin ipekteki yapısal proteindir ve serisin adı verilen başka bir protein ile kaplıdır. Serisin, ipeği işleme sürecinde yumuşak ve parlak bir yapı elde etmek için yüksek alkali çözeltilerde uzaklaştırılır. Fibroin ve serisinin dışında ipeğin yapısında waks, karbonhidratlar, inorganik maddeler ve pigmentler bulunur. İpek lifleri, çok iyi tokluk ve sertlik özelliklerinin yanında düşük yoğunluk ve kendine özgü çekme dayanımı, biyouyumluluğu, biyobozunurluğu ve kolay işlenebilir olmasından dolayı malzeme bilimlerinde öne çıkan doğal polimerlerden biri haline gelmiştir. Fibroinin jelleşmesi, diğer proteinlere kıyasla yavaş gerçekleşen bir süreçtir. Araştırma grubumuz tarafından geliştirilen bir yöntemle bu süreç hızlandırılmıştır. Fibroin çözeltilerine diepoksitlerin ilave edilmesiyle kısa sürede jelleşmenin meydana geldiği gözlenmiştir. Diepoksit molekülleri yardımıyla fibroin zincirlerindeki hidrofilik gruplar birbirine bağlanır. Bunun sonucunda fibroin molekülünün hareketliliğinin azalmasıyla birlikte hidrofobik kısımlar arasında β-tabakaların oluşması kolaylaşır. Böylece, kısa sürede fibroinin jelleşmesi gerçekleşmiş olur. Biyolojik dokulara benzerlikleri nedeniyle doku mühendisliğinde iskelet malzeme olarak kullanılabilecek en uygun malzemelerden birisi hidrojellerdir. Hidrojeller, hidrofilik polimer ağyapısıyla bu ağyapı içindeki çözücüden (su veya sulu çözelti) oluşan iki fazlı, üç boyutlu bir polimerik malzemedir. Klasik hidrojellerin pratik uygulamalarını kısıtlayan iki dezavantajı vardır. Bunlardan birisi hidrojellerin hacim değişiminin yavaş olması; ya da diğer bir değişle uyarılara hızlı cevap verememesi; diğeri ise mekanik olarak dayanıksız olmalarıdır. Hidrojellerin uyarılara hızlı cevap verebilmesi için jel boyutlarının küçültülmesi, jel yüzeyine doğrusal zincirlerin bağlanması ve makrogözenekli jellerin tasarımı; mekanik özelliklerinin iyileştirilmesi içinse çift-ağyapılı jeller, topolojik jeller, nanokompozit jeller ve kriyojeller gibi teknikler geliştirilmiştir. Kriyojelleşme prosesinde, reaksiyon çözeltisi donma noktası altındaki bir sıcaklığa getirilerek dondurulur ve reaksiyonlar donmuş reaksiyon sisteminin donmamış mikrobölgelerinde ilerler. Reaksiyonlar donma noktası altında gerçekleştiğinden dolayı ortamdaki buz kristalleri kalıp görevi yapar ve birbirine bağlı gözenekleri olan bir yapı oluşur. Reaksiyonların reaktif konsantrasyonunun yüksek olduğu donmamış mikrobölgelerde ilerlemesinden dolayı, oluşan gözenek duvarlarındaki polimer konsantrasyonu fazla olmakta ve böylece malzemenin mekanik özellikleri klasik hidrojellere göre daha iyi olmaktadır. Çift-ağyapılı jel sentez tekniğinde ise sentezlenen ilk ağyapı, içinde monomer bulunan başka bir çözelti içinde şişirilir ve ilk ağyapının içine bu çözeltinin dolması sağlanır. Ardından yeniden polimerizasyon işlemiyle çift-ağyapılı jel üretilmiş olur. İç içe geçmiş ağyapılardan oluşan çift-ağyapılı jellerde, malzemeye uygulanan kuvvetin ikinci ağyapı tarafından dağıtılmasıyla üstün mekanik özellikler elde edilebilmektedir. Bu çalışmanın amacı, doku mühendisliğinde kullanıma uygun makrogözenekli, mekanik olarak dayanıklı, biyouyumlu ve biyobozunur polimerik iskeletler üretmektir. Bu amaçla, Bombyx Mori ipek böceği kozasından elde edilen fibroinin sulu çözeltisinden, N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin (TEMED) katalizörü ve 1,4-bütandiol diglisidil eter (BDDE) çapraz bağlayıcısı varlığında -18 °C'de fibroin kriyojelleri üretilmiştir. Bu yöntemle geçtiğimiz yıllarda araştırma grubumuz tarafından literatürde ilk kez fibroinin kriyojelleşmesiyle tek-ağyapılı fibroin kriyojelleri elde edilmişti. Bu tez çalışmasında ise; tek-ağyapılı fibroin kriyojelinden yola çıkarak mekanik dayanımı arttırmak amacıyla çift-ağyapılı ve üç-ağyapılı fibroin kriyojelleri üretilmiştir. Sentezlenen tek-ağyapılı fibroin kriyojelleri, farklı fibroin konsantrasyonlarındaki çözeltilerde şişirilip kriyojelleştirilerek ikinci ağyapıda farklı konsantrasyonlarda fibroin içeren çift-ağyapılı fibroin kriyojelleri üretilmiştir. Aynı şekilde, çift-ağyapılı fibroin kriyojeli de belli bir konsantrasyonda fibroin içeren bir çözeltide şişirilip kriyojelleştirilmesiyle üç-ağyapılı fibroin kriyojeli elde edilmiştir. Bu çalışmada, mekanik olarak dayanıklı hidrojel elde etme yöntemlerinden olan çift-ağyapılı jel yöntemiyle kriyojelasyon yöntemi ilk kez birleştirilerek üstün mekanik özelliklere sahip makrogözenekli fibroin iskeletleri üretilmiştir. Elde edilen tüm kriyojellerin şişme davranışları, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile morfolojik özellikleri, Zwick-Roell ve Devotrans Mekanik Test Cihazları ile mekanik davranışları incelenmiş ve ATR- FTIR spektrumları ile de fibroin yapısı aydınlatılmıştır.