Kapiler elektroforetik yöntemlerle arı zehrindeki major bileşen melittinin analizi

Son zamanlarda, bal arıları (Apis Mellifera) tarafından üretilen arı zehri çeşitli hastalıkları alternatif tedavi edici ve önleyici olarak farmakolojik ve biyolojik alanlarda yoğun bir şekilde araştırılmaktadır. Arı zehri de apiterapideki diğer arı ürünleri olan bal, polen, arı sütü, propolis ve balmumu gibi hastalıkların önlemesinde ve iyileştirilmesinde kullanılan destek ya da tedavi yöntemlerinden biridir. Yapılan sayısız çalışmalar ve araştırmalar arı zehrinin eklem ağrısı, romatizma, ağrı, kalp damar sistemi hastalıkları, kanserli tümörler, multipl skleroz, gut, zona, ülser, tendonit, enfeksiyonlar ve deri hastalıklarındaki etkileri kanıtlanmıştır. Eski çağlardan beri Çin'de, Hindistan'da, Mısır'da, Babil'de ve Yunanistan'da arı zehri kullanılmasına ve geliştirilmesine rağmen, zehrin içeriğini oluşturan bileşenler yakın zamanda çalışılmış ve aydınlatılmıştır. Doğal bir toksin olan arı zehri, arının karın boşluğunda bulunan zehir salgı bezinden üretilir. Zehir üretimi işçi arının yetişkinliğe gelişimi boyunca artar, kovan savunması ve besin arama işleri ile ilgilenmeye başladığında en üst seviyeye ulaşır. Kraliçe arının zehir üretimi işçi arılara oranla en yüksek seviyede olur. Arıların zehir keselerinde ortalama 0.15-0.30 mg zehir bulunur. Bu zehir açık renkli olup, kokusuz, keskin ve acı bir tada sahiptir. İçeriğinde birçok kimyasal yapı bulunmaktadır. Bunlar proteinler, enzimler, peptitler, aktif aminler, mineraller ve karbonhidratlardır. Arı zehri 18 farmakolojik aktiviteye sahip bileşikten oluşmaktadır. Bunlardan başlıcaları, histamin, melittin, apamin, epinefrin, mast hücre degranülasyonu peptidi, fosfolipaz A2, dopamin, hyaluronidaz enzimleridir. Melittin zehrin major kısmını oluşturan ve asıl acıya sebep olan peptitdir. İlk defa 1954 yılında tanımlanmıştır. Melittin kuru arı zehrinin %50'ye yakınını oluşturur, farmakolojik ve fizyolojik olarak antibakteriyel, antifungal, sinir sistemi düzenleyici, radyasyondan koruyucu etkilere sahip, suda çözülebilir özelliktedir. Melittin 26 amino asitten oluşan doğrusal bir yapıya sahip küçük bir peptitdir. İlk 20 amino asit kısmı çoğunlukla apolarken, C terminalli kısımdaki 5'li aminoasit bölümü polar ve yüksek derecede baziktir. Çok güçlü antienflamatuar özelliğe sahiptir. Kanser, bakteri, mantar, virüs ve enfeksiyonlara karşı engelleyicidir. Membran yüzey gerilimini ve kanın pıhtılaşmasını azaltır. Melittinin daha birçok biyolojik etkileri bilimsel çalışmalarla araştırılmaktadır. Kapiler elektoforez, kısa analiz süresi, az miktarda çözücü sarfiyatı, küçük numune hacminde örnek enjeksiyonu, kullanım kolaylığı ve yüksek ayrım gücü gibi birçok avantaj sağlayan modern analitik bir metotdur. Kapiler elektroforez metodunda, yüklü tanecikler sıvı ya da katı bir ortamda elektriksel potansiyel uygulanarak, etkin yüzeylerinin büyüklüklerine oranla belirli bir pH da göç etmesi ve ayrılma prensibine dayanmaktadır. Her bir molekül kendisine ait olan elektroforetik hareketliliğe ve sistem içerisinde kullanılan tampon çözeltinin elektrik akım altında sağlamış olduğu elektroosmatik akışa sahiptir. Elektrik akım altında kapiler bir kolonun içerisinde ayrım gerçekleşir. Kapiler elektroforezde proteinlerin, peptitlerin, amino asit ve bir çok benzeri moleküllerin ayrımı gerçekleştirilebilmektedir. Kapiler kolonun iç yüzeyi silanol grupları ile kaplıdır, pH'ın 2 değerinden büyük durumlarda silanol gruplar deiyonize olarak, tampon çözeltiden gelen pozitif yüklerle çift katlı yük katmanını oluşturur ve elektroosmatik akış sağlanmış olur. Bileşiklerin ayrılmasında hem elektroosmatik akış hem de moleküllerin elektoforetik hareketliliği ile sağlanır. Sağladığı yüksek verim ve seçicilik sayesinde kapiler elektroforez protein, peptit ve aminoasit araştırmalarında tercih edilen bir ayrıştırma yöntemidir. Peptit ayrımı küçük moleküllere benzese de peptidi oluşturan aminoasitlerden ötürü farklıdır. Peptitlerin farklı elektroforetik hareketliliği, moleküler ağırlık, konformasyon, çözünürlük, yük, boyut, hidrofobisite ve diğer biyomoleküllerle etkileşimi özelliklerinden dolayı sağlanır. Analizler rutin bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Yapılan çalışmalarda çözeltilerdeki melittin peptit konsantrasyonları Agilent 1600 kapiler elektroforez cihazı ile belirlenmiştir. Melittin peptitinin etkin ayrımı kapiler duvarın iç yüzeyine yapışma özelliği gösterdiği için düşük seviyelerde gözlenmiştir. Bu durum negatif yüklü silanol gruplarıyla melittin peptitinin positif yüklü kısımları arasındaki elektrostatik etkileşiminden kaynaklanmaktadır. Pozitif yük ve negatif yük etkileşimini engellemek için iki farklı yaklaşım çalışılmıştır. Bu çalışmanın ilk bölümünde, silanol gruplarınının deiyonize olmasını engellemek ve elektroosmatik akışı yok etmek için çalışma tamponunun pH'ı 2 den daha küçük bir değer olarak seçildi. Denemeler sonucunda, düşük pH çalışmasında melittinin ayrılmasında en uygun ayırma şartlarının, çalışma tamponu olarak pH: 1,55'de fosforik asit çözeltisi, 25 kV voltaj 1000 mbar basınçla 6 saniye örnek enjeksiyonu olduğu tespit edilmiştir. Kalibrasyon eğrisinin doğrusal aralığı 70-350 µM aralığında, 0,983 korelasyonla tespit edilmiştir Bu optimal şartlar altında yöntemin melittin peptiti için tayin sınırı (LOD) 19,3 µg/mL olarak tespit edilmiştir. Bu çalışmanın ikinci bölümünde, bir kapiler kaplama işlemi tanımlanmıştır. Kaplama malzemesi olarak polietilenimin (PEI) kullanılmış, böylece melittin peptitinin pozitif yüklü kısımlarının kapiler kolonun negatif silanol grupları içeren iç yüzeyle etkileşimi engellenmeye çalışılmıştır. Kaplama prosesi kapiler kolondan 1000 mbar basınçta 30 dakika boyunca, 1 M sodyum hidroksit çözeltisi, ardından 1000 mbar basınçta 15 dakika boyunca su, 1000 mbar basınçta 10 dakika boyunca %10'luk PEI çözeltisi geçirip, daha sonra kapilerin içinde PEI çözeltisini 1 saat bekletmek, ardından 1000 mbar basınçta hava ile polimer çözeltisini çıkarmak, en son olarak da 15 dakika boyunca 1000 mbar basınçta deiyonize su ve 15 dakika boyunca 1000 mbar basınçta çalışma tamponu geçirilerek tamamlanmıştır. PEI molekülü silika kapiler yüzeyindeki negatif yüklü silanol grupları ile güçlü bir etkileşime girer. Kapiler elektroforezde kaplayıcı olarak katyonik bir polimer olan polietileniminin kullanılmasıyla beraber, kapiler içindeki elektoosmotik akış katotdan anoda doğru yönlenir. Adsorplanan PEI tabakası geniş bir pH aralığında pozitif yüke sahiptir. PEI ile kaplanmış kapilerde elektroosmatik akış büyüklüğü ve stabilitesi, farklı tampon çözeltileri, tampon konsantrasyonları ve pH'larda, iyonik şiddet ve organik çözücü eklemeleri gibi şartlar altında incelenmiştir. Geliştirilen kaplama işlemi daha sonra melittin peptiti analizinde uygulanmıştır. Bu çalışmadaki denemeler sonucunda, kapiler kolonun %10'luk PEI çözeltisi ile kaplanmış, melittin peptitinin ayrılmasında en uygun ayırma şartlarının, çalışma tamponu olarak pH: 5.50'de asetik asit çözeltisi, -25kV voltaj 50 mbar basınçla 6 saniye örnek enjeksiyonu olduğu tespit edilmiştir. Kalibrasyon eğrisinin doğrusal aralığı 35-350 µmol/L aralığında, 0,996 korelasyonla tespit edilmiştir. Bu optimal şartlar altında yöntemin melittin peptiti için tayin sınırı (LOD) 10.0 µg/mL olarak tespit edilmiştir. İki yöntemin de geliştirilmesindeki en önemli amaç melittin peptitinin pozitif yüklü kısımlarıyla, kapiler kolonun iç yüzeyindeki negatif yüklü silanol gruplarının etkileşimini olabildiğince engellemek ya da yok etmektir. Birinci yöntemde elektroosmotik akış çalışılabilecek en düşük pH değerlerini kullanarak olabildiğince yok edilmeye çalışılmış, böylece duvar negatif yükü bastırılmıştır. Melittinin duvara yapışmadan ayrımı ve analiz tekrarlanırlığı sağlanmıştır. Diğer yöntemde ise, kapiler kolonun iç yüzeyi pozitif yüklü PEI polimeri ile kaplanmış. Böylelikle melittinin pozitif yüklü kısımlarıyla negatif yüklü silanoller arasındaki etkileşim engellenmiştir. Bu çalışmada da melittinin ayrımı ve tekrarlanabilirlik sonuçları sağlanmıştır. Sonuç olarak her iki yöntemde de arı zehiri içinde melittin tayini hassas ve tekrarlanabilir şekilde tespit edilmiştir. Deney süresinin daha kısa olması nedeniyle gerçek örnekte miktar tayini silika kapilerde geliştirilen yöntemle yapılmış ve Karadeniz Bölgesi arılarından toplanan kuru arı zehri örneğinde melittin 245 mg/g olarak bulunmuştur.