Membran biyo-reaktor yardımıyla biyoetanol fermantasyon sisteminde bakteri kontaminasyonu giderimi

Biyoetanol fermantasyonu monomerik şeker gruplarının maya fermantasyonu sonucunda etanol ve karbon dioksite dönüşmesini sağlayan anaerobik bir prosestir. Başlıca kullanılan hammaddeler mısır veya şeker kamışı gibi tarım ürünleri olmakla birlikte lignoselüloz içerikli tarımsal atıklardan üretimi de mevcuttur. Fosil yakıtların gideren artarak kullanımı çevre kirlenmesinin yanı sıra küresel iklim değişikliği gibi çok yönlü sorunlara yol açtığı göz önünde bulundurulduğunda, yerel olarak üretilebilen bir likit enerji kaynağı olan bioethanol, fosil yakıt yerine geçebilecek sürdürülebilir bir alternatiftir.Kendi başına kullanılabileceği gibi, benzinle karıştırılarak (%30' a kadar) da taşıt yakıtı olarak kullanılabilir. Oksitlenmiş bir yakıt olduğundan benzin yerine taşıt yakıtı olarak kullanılması hava kalitesinde de pozitif bir etki yaratır. Dünya çapında devlet birimlerinin ve sanayinin biyoetanole artan ilgisi sayesinde 2007-2015 arasında biyoetanol üretimi iki katına çıkmıştır. Üretimde başı çeken ülkeler Brezilya ve ABD'dir ve 2015 RFA (Yenilenebilir Yakıtlar Birliği) verilerine göre toplam küresel biyoetanol üretiminin %85'i bu iki ülke tarafından gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte biyoethanol sanayisinde verimi etkileyen başlıca sorunlardan biri proses sırasında ve öncesi çeşitli yollardan sisteme girebilen bakteri kontaminasyonudur. Fermantasyon prosesinde ortaya çıkan bakteri kontaminasyonu nihai etanol üretimi verimliliği, maya metabolik aktivitesi ve nihai ürünün kalitesini olumsuz etkilemekte ve sonraki işlem kademelerinin bedelini artırmaktadır. Sanayi ölçekte yapılan fermantasyonda tamamen kontaminasyondan uzak bir sistem elde edilmesi oldukça zor, besleme çözeltisi ve ekipmanların steril tutulması ise masraflı ve zahmetli bir iştir. Kontaminasyonun çok çeşitli yollardan sisteme dahil olabileceği göz önünde tutulduğunda konvansiyonel anti-mikrobiyal bileşiklerin kullanımı uzun dönemde bakteri kontrolü ve sistem dezenfeksiyonu için yeterli olmamaktadır. Bu çalışmada fermantasyon sürecinde oluşan bakteri kontaminasyonunun asit-baz işlemi veya antibiyotik katımı yerine fiziksel yollarla giderilmesi araştırılmıştır. Bu amaçla batık membran biyoreaktör ve IPC (Integrated Permeate Chanel) düz levha membran panellerinin birlikte yer aldığı bir konfigürasyon kullanılmıştır. Bu konfigürasyon ile maya hücreleri biyoreaktör içinde tutulurken kontaminasyona neden olan bakteri hücrelerinin reaktör dışına atılabileceği sürekli beslemeli bir bioethanol fermantasyon sistemi elde edilmesi amaçlanmıştır.xxvii Etanol üretici mikroorganizma olarak en yaygın kullanılan maya türü olan Saccharomyces cerevisiae seçilmiştir. Kontamine bakteri türü olarak daha önce Boras Üniversitesi dahilindelaboratuar ölçekli bir etanol fermantöründe kontaminasyona neden olduğu tespit edilerek izole edilmiş olan Enterobacter cloacae seçilmiştir. Her iki tür ayrı ve beraber olarak fermantasyon koşullarında (30 C° ve pH 5) ve sentetik besleme çözeltisi içerisinde,sallanan su banyosunda24 saat büyütülmüştür. Kültürler olgunlaştığında steril koşullarda örnekler alınmış ve gram boyama yöntemiyle ışık mikroskobu altında hücre morfolojileri incelenerek hücre boyutları maya için hücre çapı 3-4 µm, bakteri için 1-1.5µm olarakbelirlenmiştir. Ayrıca mikroorganizmaların metabolik hareketlerinin ve büyüme hızlarının belirlenmesi amacıyla spektrofotometri, HPLC, plaka aşılama ve kuru ağırlık ölçümleri yapılmıştır. Saccharomyces cerevisiae veEnterobacter cloacae bakteri kompleksinin selektif olarak ayrılmasını incelemek amacıyla öncelikle kültürler MBR'a PBS çözeltisi içinde konulmuştur. Nütrient yokluğunda bakteri ve maya kültürlerinin metabolik aktiviteleri yavaşlayarak hücredışı bileşik üretimleri durma noktasında geldiğinden sadece boyutsal olarak membran tarafından reaktör içinde tutulup tutulmadıklarını gözlemlemek mümkün olmuş, mikroorganizmaların ayrı ve beraber olarak konulduklarında membran yüzeyiyle etkileşimleri incelenmiştir. Bu sayede kullanılacak membran plakalarının por büyüklüğü, sistemin optimum seyreltme oranı ve reaktöre konacak kültürlerin miktarının belirlenmesi amaçlanmıştır. 1.5 ve 2 litrelik hacimleri olan laboratuar ölçekli iki ayrı reaktör kullanılmış ve bu reaktörlerde 0.25 ve 0.75 1/saat aralığında seyreltme oranları, 1 ve 2.4 µm por çapına sahip iki ayrı polieter sülfan (PES) membran panel tipi denenmiştir. İlk aşamada maya ve bakteri kültürleri ayrı olarak reaktöre konularak membran özelliklerinin mayanın reaktör içinde tutulması ve bakterinin atılması için uygun olup olmadığı araştırılmıştır. Bu amaçla sadece maya bulunan kültürle 1 ve 2.4 µm por çaplı iki ayrı membran panelinin kullanıldığı iki ayrı deney yapılmıştır.Sistem akısının 110 L/m2/saat ve reaktör içindeki kültür konsantrasyonunun 0.6 g/L olduğu deneylerde membran yüzeyindeki basıncın ve reaktör içindeki türbiditenin sabit olduğu gözlemlenmiş ve membranın mayayı reaktör içinde tutmak için uygun olduğu sonucu çıkarılmıştır. Sadece bakteri bulunun kültürle PBS çözeltisi içinde yapılan deneyler sonucunda optimum konfigürasyonda (akı; 150 L/m2/saat, 2,4 µmpor çaplı membran, reaktör içindeki bakteri kültür konsantrasyonu; 0.04 g/L)membran yüzeyinde basınç artışı olmadığı halde % 93 oranında kontaminasyon gideriminin sağlanabildiği spektrofotometrik yöntemlerle belirlenmiştir. Sonraki aşamada bakteri ve maya kültürleri ayrı ve beraber olarak kesikli beslemeli reaktör sisteminde, membran yokluğunda, sentetik besleme çözeltisinde büyütülmüş ve bu koşullar altındaki metabolik aktiviteleri ve büyüme hızları gözlemlenmiştir. Yapılan deneyler sonucunda mayanın varlığının bakterinin büyümesini glikoz tüketiminde rekabete yol açması ve etanol üretimi sayesinde olumsuz etkilediği sonucuna varılmıştır. PBS çözeltide yapılan MBR ve kesikli beslemeli reaktör sisteminde yapılan deneyler sonucunda elde edilen bulgular doğrultusunda MBR sisteminde sentetik nütrient için bakteri büyütülmüş ve sistemden atılması denenmiştir. Ancak akının 37 L/m2/saat, reaktör içindeki başlangıç bakteri konsantrasyonunun ise 0.001 g/L'ye düşürülmesinexxviii rağmen 6. saatte bakterinin eksponansiyel büyüme fazına geçmesini takiben membran yüzeyindeki basınç artışı kontrol edilememiş ve sürekli bakteri giderimi yapılamıştır. Bunun üzerine bakteri ve maya MBR sistemine sentetik besleme çözeltisinde birlikte konulmuş ve fermantasyon koşullarında büyütülmüştür. Bu aşamada akının 72-16 L/m2/saat, reaktör içindeki başlangıç bakteri konsantrasyonunun 0.001-0.0001 g/L, mayanın ise 0.14-0.36 g/L olduğu koşullarda denemeler yapılmıştır. Reaktör içindeki pH'ınmanüel olarak 10. ve 24. saaate konsantre NaOH eklenerek 5'te kontrol edildiği deneylerde akının 16 L/m2/saat, reaktör içindeki başlangıç bakteri konsantrasyonunun 0.001g/L, mayanın ise 0.36 g/L olduğu koşullarda sürekli bakteri giderimi sağlanabildiği membran yüzeyindeki basıncın sabit gittiğinin gözlenmesiyle ispatlanmıştır. Daha sonra manüel olarak yapılan pH kontrolü yerine otomatik olarak konsantre NaOH eklenmesiyle pH'ın 5'te tutulması denenmiş, ancak reaktör içindeki başlangıç bakteri konsantrasyonunun 0,00001 g/L'ye kadar düşürülmesine rağmen membran yüzeyindeki basıncın kontrol edilememesi nedeniyle sürdürebilir bir bakteri giderimi sağlanamamıştır. Sonuç olarak optimum sistem konfigürasyonunda (ideal por büyüklüğü, akı ve başlangıç maya ve bakteri kültürlerinin büyüklüğü) pH'ın 4-5 arasında tutulması halinde beslemeli membran biyoreaktör sisteminde sürekli bakteri kontaminasyonu gideriminin sağlanabileceği sonucuna varılmıştır.