Discovery of new cellulose-hydrolyzing enzymes using metagenomic approach

Fosil yakıtlar tükenebilir kaynaklar olmakla birlikte tüketimleri çevreye zararlı kimyasalların salımına neden olmaktadır. Fosil yakıtların çevreye olan zararlarını azaltmak ve enerjinin sürdürebilirliğini sağlamak için alternatif enerji kaynaklarının geliştirilmesi gerekmektedir. Selülozik biyokütlelerin parçalanması ile elde edilen biyoyakıt enerji gereksiniminin karşılanması için yüksek potansiyelli bir alternatif olarak görülmektedir. Fakat bu alanda yürütülen yoğun araştırmalara rağmen sürdürülebilir ve ekonomik açıdan uygulanabilir biyoyakıt üretimi sağlanamamıştır. Bunun sebebi, selülozik yapının parçalanamaya dirençli yapısıdır. Günümüzde biyoyakıtın endüstriyel ölçüde üretiminin yapılmasının önündeki en büyük engel optimum düzeyde çalışan yüksek kaliteli enzimlerin eksikliğidir. Selülozun tamamen parçalanması birden fazla enzimin eş zamanlı çalışmasını gerektirmektedir. Selülozu parçalamakla görevli enzimler, selülazlar, yapılarına ve aksiyon mekanizmalarına bağlı olarak üç grupta sınıflandırılmışlardır: endoglukanaz, ekzoglukanaz ve beta-glukozidaz. Günümüzde amacına uygun optimum şartlarda çalışan enzimlerin yetersizliğinden dolayı selülazların ticari kullanımı sınırlıdır. Yeni enzimlerin keşfi için dikkat çeken yöntemlerden biri doğal çeşitliliğin uygun amaç doğrultusunda taranmasıdır. Her türlü çevresel koşulda yaşamaya adapte olmuş mikroorganizmalar yeni enzimlerin keşfi için önemli kaynak teşkil etmektedir. Metagenomik yaklaşım, çevresel örneklerden direkt DNA izolasyonunu içeren, bu sebeple kültivasyondan kaynaklanan genetik bilgi kayıplarını en aza indirgeyen bir yöntemdir. Bu yöntem ortamda bulunan tüm mikroorganizmanın genetik materyalinin kazanımını sağlamaktadır. Yapılan çalışmada metagenomik yöntem kullanılarak selüloz parçayan yeni enzimlerin keşfi amaçlanmıştır. Metagenomların eldesi için çeşitli ortamlardan örnekler elde edilerek metagenomik DNA izolasyonları yapılmıştır: Bu örnekler Dalaman Kaynak Suyu, Dalaman Gölü, Emet Kaplıcaları, Kuzuluk Kaplıcaları, Emet Kaplıcaları ve Dalaman Gölü'nde bekletilen samanlar, çiftlikte yetiştirilen ve TÜBİTAK MAM kampüsünden toplanan çekirgeler ve TÜBİTAK MAM kampüsünden alınan çürümeye başlamış çimendir. Metagenomik DNA'ların örneklerden izolasyonu için ticari kitler kullanılmıştır. İzolasyonu yapılan DNA'lar metagenomik kütüphanelerin oluşturulmasında kullanılmıştır. Kütüphane oluşturulurken üretici firmanın tarifine uygun şekilde ticari kit kullanılmıştır. HiSeq2500 (Illumina, ABD) dizileme sistemi ile tüm metagenom sekans dizilemesi gerçekleştirilmiştir. Dizileme sistemi ile okunan parçaların birleştirilmesinde, filogenetik çalışmalarda ve gen anotasyonunda biyoenformatik araçlardan yararlanılmıştır. Analizler sonucu metegenomlarda 1238 selülaz geni olduğu görülmüştür. Selülaz olarak anotasyonu yapılan genlerden 63 tanesi enzim keşfi için seçilmiştir. Her aday gene uygun özel primer çifti tasarlanmıştır ve uygun reaksiyon koşullarında metagenomik DNA'lar şablon olarak kullanılarak genler çoğaltılmıştır. Seçilen 63 genden 54 tanesi başarıyla çoğaltılmıştır. Amplifikasyonu yapılan genler pET-22b(+) vektörüne klonlanmıştır. Aday geni içeren pET-22b(+) vektörlerinin, proteinlerin ekspresyonu için, E. coli BL21 (DE3) suşuna transformasyonu yapılmıştır. Yapılan doğrulama sonucunda 54 genin başarı ile E. coli BL21 hücrelerine klonlandığı gözlemlenmiştir. Rekombinant protein üretimi besi ortamına 1 mM IPTG eklenerek indüklenmiştir.Aday genlerin SDS-PAGE ile analizleri sonucu 22 proteinin başarı ile üretildiği gözlemlenmiştir. Aday genlerinden başarıyla ekspres edilen 22 tanesi biyokatalitik aktivite için test edilmiştir. Endoglukanaz ve ekzoglukanaz aktivitesi için CMC substrat olarak kullanılırken, beta-glukozidaz için pNPG kullanılmıştır. Aktivite tayini CMC'ye karşı aktivite gösteren bir enzimin varlığı gösterirken, pNPG'ye aktivite gösteren enzim gözlemlenmemiştir. Genin spesifik aktivitesinin belirlenmesi için protein saflaştırması yapılmıştır. Saflaştırılan proteinin miktar tayini Bradford yöntemi kullanılarak yapılmıştır. Saflaştıran protein enzim aktivite testi için kullanılmış ve spesifik aktivite spektrometrik ölçümlerden yararlanılarak belirlenmiştir. Bulunan endoglukanaz enziminin spesifik aktivitesi bir miligram protein başına 0,44 ünite olarak hesaplanmıştır.