Mikrokriyojeller ile transferrin saflaştırılması

Sunulan tez kapsamında, plazmadan transferrin saflaştırılması amacıyla afinite kromatografisini temel alan, immünoafinite ve moleküler baskılanmış olmak üzere 2 farklı mikrokriyojel hazırlandı. İmmünoafinite mikrokriyojel için poli(2-hidroksietil metakrilat-glisidil metakrilat) P(HEMA-GMA) taşıyıcı matris olarak seçildi ve mikrokriyojel yapısındaki epoksi grupları sayesinde herhangi bir aktivasyon ajanı kullanımına ihtiyaç olmadan anti-transferrin (anti-Tf) antibadiler çeşitli başlangıç derişimlerinde mikrokriyojellere immobilize edildi. Moleküler baskılanmış mikrokriyojel için ise poli(2-hidroksietil metakrilat-N-metakriloil-(L)-triptofan) P(HEMA-MATrp) matris olarak seçildi. Bunun için hidrofobik ligand olarak kullanılan L-triptofan amino asidinin polimerleşebilen türevi olan N-metakriloil-L-triptofan (MATrp) monomeri sentezlendi. Sentezlenen monomer nükleer manyetik rezonans, Fourier dönüşümlü kızılötesi (FTIR) spektroskopisi, Raman spektroskopi çalışmaları ile karakterize edildi. Ardından [P(HEMA-MATrp)] mikrokriyojeller 2-hidroksietil metakrilat (HEMA) ve MATrp monomerlerinin N,N'-metilenbis(akrilamid) çapraz bağlayıcı ile insan serum transferrin (hsTf) varlığında (baskılanmış mikrokriyojel) ve yokluğunda (baskılanmamış mikrokriyojel) -16°C'da serbest radikal polimerizasyonu ile üretildi. Mikrokriyojeller şişme testleri, Brunauer–Emmett–Teller yöntemi ile yüzey alanı ölçümleri, FTIR spektroskopisi, Raman Spektroskopi, helyum piknometre, optik mikroskop ve taramalı elektron mikroskobu ile karakterize edildi. Ardından mikrokriyojellerin optimum çalışma koşullarını saptamak amacıyla optimizasyon çalışmaları yürütüldü. Bu çalışmalar sonucunda her iki mikrokriyojel için en uygun pH değerinin 6.0 olduğu saptandı ve immünoafinite ve baskılanmış mikrokriyojel için bu pH değerinde maksimum adsorpsiyon kapasitesi sırasıyla 9.82 mg/g ve 2.11 mg/g olarak bulundu. Hem immünoafinite hem de baskılanmış mikrokriyojeller için Langmuir adsorpsiyon izotermi ve pseudo-ikinci-derece kinetik modelinin adsorpsiyon süreci ile uyumlu olduğu gözlendi, bu adsorpsiyonun tek tabakalı ve kimyasal kontrollü olduğu anlamına gelmektedir. Baskılanmamış mikrokriyojel ile kıyaslandığında baskılanmış mikrokriyojelin seçiciliğinin insan serum albümin (HSA) ve miyoglobin (MYB) için sırasıyla 2.10 ve 2.24 kat daha fazla olduğu bulundu. İmmünoafinite P(HEMA-GMA) mikrokriyojel ve baskılanmış P(HEMA-MATrp) mikrokriyojel ile ayrı ayrı yapay plazmadan saflaştırılan hsTf'in saflığı sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile incelendi. Mikrokriyojellerin tekrar kullanılabilirliklerinin incelendiği çalışma sonucu aynı mikrokriyojelin onuncu kullanımından sonra, maksimum hsTf adsorpsiyon kapasitelerinin immünoafinite mikrokriyojel ve baskılanmış mikrokriyojel için sırasıyla yaklaşık %20 ve %10 azaldığı hesaplandı.