Analysis of the mitotic kinase functions by chemical genetics approaches

Mitoz, hücre döngüsünün en kısa evresi olmasına rağmen hücresel yapı ve işlevlerde çok büyük değişiklikleri içerir. Mitoza giriş ve ilerleme, sinyal yolaklarından oluşan ağların ve otoamplifikasyon döngülerinin dinamik işleyişleriyle garantilenmektedir. Mastl kinaz, protein fosfataz 2A'yı (PP2A) dolaylı olarak inhibe ederek, mitoz sırasında mitotik substratların hiperfosforile hallerinin korunmasını sağlar. Mastl kinaz için yapılan gen yok etme çalışmaları; hücrelerde kromozomların ayrılmasında kusur ve bunun sonucu olarak sitokinezin gerçekleşememesi ve mitotik substratların fosforilasyon düzeylerinde azalmalar göstermiştir. Mastl kinazın mitotik fonksiyonlarının daha iyi anlaşılabilmesi ve karakterize edilebilmesi için; enzimin analog duyarlı varyantlarını oluşturmayı amaçladık. Öncelikle insan hücre hatlarında, endojen Mastl lokusuna CRISPR-Cas9 metoduyla ilgili mutasyonların yerleştirilmesi amaçlandı. Başarısız denemelerin ardından çalışmaları koşullu knockout fare embriyonik fibroblast hücrelerinde yapmaya karar verdik. Retroviral vektörler aracılığıyla, analog duyarlı kinaz varyantlarını ekzojen olarak ekspresse ettik ve oluşturulan stabil hücre hatları, endojen Mastl lokusunun delesyonu için indüklendiler. Amacımız, ATP'yi bağlayabilen ve normal kinaz aktivitesi veren ve buna ek olarak bir ATP analoğu inhibitörüne duyarlı olan bir enzim oluşturmaktı. Çalışmanın son durumunda, knockout indüklenmiş stabil hücre hatlarının sağlıklı olmadığını gözledik. Mutasyonlarının enzim aktivitesine olası olumsuz etkilerinden ve yetersiz seviyede ektopik ekspresyondan şüphelendiğimiz için, azalan enzimatik aktiviteyi daha yüksek ekspresyon düzeyleriyle telafi edebilmek amacıyla, lentiviral expresyon sistemlerine geçiş sürecinde ön denemeler yapılmaktadır.