Modifiye edilmiş kitosan boncuklar üzerine katalaz enziminin immobilizasyonu

Enzime immobilizasyon teknikleri enzimin tekrar kullanımına ek olarak, üretim ortamından ayrılması ve sürekli üretime olanak vermesi gibi avantajlar sağlar. İmmobilize biyokatalizörün başarılı bir şekilde uygulanması ve geliştirilmesi için, enzim taşıyıcısı genellikle en önemli bileşen olarak göz önünde bulundurulur. İmmobilize enzim reaktörlerinin kolaylık sağlamasına rağmen taşıyıcı materyallerin pahalılığı yüzünden hala immobilize enzimlerin geniş uygulama alanları az bulunmaktadır. Bundan dolayı, enzim immobilizasyonu için ideal bir taşıyıcı olarak bilinen kitosan gibi ucuz taşıyıcılar üzerine enzim immobilizasyon teknikleri geliştirilmesi gerekir. Kimyasal olarak kitinin deasetilasyonuyla türeyen kitosan metal iyonları ve organik maddelerin uzaklaştırılması için ucuz ve çok yönlü bir polimerdir.Bu çalışmada kitosan ve modifiye kitosan boncuklar üzerine kovalent bağlama yöntemiyle katalaz enziminin immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Kitosanın, kil ve Fe3O4 ile fiziksel modifikasyonu, L-lizin ile kimyasal modifikasyonu gerçekleştirilmiştir. Kitosan, kitosan-kil(1:1) ve kitosan-Fe3O4(1:0,2) asetik asit çözeltisi içinde çözüldü ve enjektör yardımıyla TPP çözeltisi içine damlatıldı. Belli bir süre olgunlaşması için bekletildi. Lizin modifiye kitosan boncukların hazırlanması için öncelikle kitosan boncuklar hazırlandı ve daha sonra bu boncuklar L-lizin ile kimyasal olarak modifiye edildi. Kitosan ve modifiye kitosan boncuklar üzerine immobilize edilen katalazın karakterizasyon ve optimizasyon çalışmaları (optimum glutaraldehit konsantrasyonu, optimum çapraz bağlama süresi, optimum immobilizasyon süresi) gerçekleştirildi. Çapraz bağlayıcı olarak glutaraldehit kullanıldı ve uygun glutaraldehit konsantrasyonu kitosan, kitosan-kil ve magnetik Fe3O4 modifiye kitosan boncuklar için % 3 bulunurken lizin modifiye kitosan boncuklar için % 2 olarak belirlendi. Taşıyıcı üzerine bağlanan protein miktarını belirlemek için Bradford yöntemine göre serbest enzim, filtrat ve yıkama sularında protein tayini yapıldı. Kitosan, kitosan-kil, kitosan-Fe3O4 ve kitosan-lizin boncuklar üzerine bağlanan protein miktarı sırasıyla % 57.14, % 60.71, % 78.57 ve % 73.21 olarak hesaplandı. İmmobilize katalazın aktivitesi gram taşıyıcı başına düşen aktivite olarak hesaplandı. Kitosan, kitosan-kil,Fe3O4 modifiye kitosan ve lizin modifiye kitosan boncukların aktiviteleri sırasıyla 60.83 U/g, 79.07 U/g, 88.50 U/g ve 121.19 U/g olarak ölçüldü. Serbest ve immobilize katalazın optimum pH çalışmalarında pH 4.0-9.0 arasında değişen pH'larda aktivite ölçümleri yapıldı. Farklı taşıyıcılar üzerine immobilize edilen katalazın optimum pH'ı serbest katalaza göre değişmediği ve pH 7.0 olarak kaldığı belirlendi. Optimum sıcaklık çalışmalarında 5 0C-60 oC arasında değişen sıcaklıklarda serbest ve immobilize katalazın aktiviteleri ölçüldü. Optimum sıcaklık, serbest ve immobilize katalaz için 35 oC olarak saptandı. Sıcaklık ve pH stabilite çalışmalarında immobilize ve serbest katalaz farklı pH ve sıcaklıklarda 1 saat bekletilerek 1 saat sonrasında geri kalan aktiviteleri ölçüldü. İmmobilize enzimin serbest enzime oranla pH ve sıcaklık değişimlerine dayanıklılığının daha iyi olduğu gözlemlendi. Kitosan, kitosan-kil, Fe3O4 modifiye kitosan, lizin modifiye kitosan boncuklar ve serbest enzimin KM değerleri sırasıyla 33,76 mM, 30,33 mM, 26,66 mM, 27,0 mM ve 14,28 mM olarak hesaplanmıştır. Kitosan, kitosan-kil, Fe3O4 modifiye kitosan, lizin modifiye kitosan boncukların ve serbest enzimin Vmax değerleri 141,92 U/mg protein dk, 176,6 U/mg protein dk, 195,04 U/mg protein dk, 197,5 U/mg protein dk ve 3076,92 U/mg protein dk olarak hesaplandı. Elde edilen sonuçlardan immobilize katalazın KM değerinin serbest enzime göre arttığı Vmax değerinin ise azaldığı belirlenmiştir. Depolama çalışmalarında ise serbest katalaz ve immobilize katalaz 70 gün boyunca 4 oC ve 25 oC'de depolanarak belirli aralıklarla aktiviteleri ölçüldü. Depolama çalışmaları sonucunda immobilize katalazın serbest katalaza göre 4 oC ve 25 oC'de daha karalı olduğu saptandı. Farklı taşıyıcılar üzerine immobilize edilen katalazın tekrar kullanılabilirliğini belirlemek için aynı boncuklarda 100 defa tekrarlanan aktivite ölçümleri sonucunda hala aktivite gösterebildikleri tespit edildi.