Demire dirençli Saccharomyces cerevisiae'nın moleküler ve fizyolojik karakterizasyonu

Yerkabuğundaki en yaygın dördüncü element olan demir, canlılar için gerekli bir element olmakla birlikte, yüksek konsantrasyonlarda canlılar üzerinde toksik etki göstermektedir. Demirin en yaygın iki oksidasyon hali (Fe+3 ve Fe+2) arasındaki elektron taşınım potansiyeli, demiri tüm canlılar için önemli kılmaktadır. Demir iyonları oksidatif fosforilasyonda da önemli rol oynar. Demir; bakır, çinko, nikel ve kobalt gibi diğer geçiş metalleri ile benzer fiziksel ve kimyasal özellikler göstermektedir. Geçiş metallerinin iyonları ortak taşınım sistemlerine sahiptir veya bazı yapılarda birbirlerinin yerini alabilir. Bu nedenle, demir direnci ile diğer geçiş metallerine olan direncin ortak özelliklerinin olması beklenebilir. Kalıtsal hemokromatozis ve anemi, demire dayalı temel hastalıklardandır. Demir ile ilgili anahtar proteinlerin mutasyonları sonucunda, bu gibi hastalıklar ortaya çıkmaktadır. Bu proteinler, demirin taşınması, algılanması, metabolize edilmesi ve kullanımı durumlarında fonksiyon gösterirler. Demir taşınımının aydınlatılması veya demirin ökaryotlarda kullanımı ve önemine dair elde edilen en ufak bir bilgi, bu hastalıkların temelinde yer alan mekanizmalara ışık tutabilir. Saccharomyces cerevisiae mayası, endüstriyel uygulamalarda ve temel bilim araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir mikroorganizmadır. Temel bilim araştırmalarında kullanılmasının en önemli sebepleri, en basit ökaryotik hücre modeli olması ve genetik modifikasyonunun kolaylıkla yapılabilmesidir. Endüstriyel uygulamalarda tercih edilme sebepleri ise; düşük pH değerlerinde kolaylıkla üreyebilmesi, antibiyotiklere karşı hassasiyetinin olmaması, bakterilere kıyasla toplum sağlığına olumsuz etkilerinin olmaması, yine bakterilere kıyasla daha büyük olduğu için daha kolay hasat edilebilmesi, hücre dışına sentezlenen proteinlerin saflaştırılmasının daha kolay olması ve post-translasyonal modifikasyonları yaparak istenilen konformasyonda proteini sentezleyebilmesidir. Metabolik mühendislik, rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak, hücresel aktivitelerin arttırılmasını veya stres toleransı gibi hücresel özelliklerin geliştirilmesini sağlar. Bailey, 1991'de metabolik mühendisliği; hücrenin enzimatik, taşıma ve düzenleyici işlevlerinde rekombinant DNA teknolojisi ile değişiklikler yapılarak hücresel aktivitelerin iyileştirilmesi olarak tanımladı. Bu tanım, bilimsel bir disiplin olarak metabolik mühendisliğin literatürdeki ilk tanımı oldu. Mikrobiyal metabolik mühendislikte genel olarak, özellikleri geliştirilmek istenilen mikrobiyal suşa heterolog genler ve/veya suşun iyileştirilmesi için gerekli olan düzenleyici elementler kazandırılmaktadır. Metabolik mühendislik çalışmaları; belirli bir genetik manipülasyon setinin hangi hücresel işlevde istenilen değişimin elde edilmesinde etkili olduğunun belirlenmesine, uygulanmasına ve geliştirilmesine yardımcı olur. Fakat bu çalışmalarda sıkça karşılaşılan bir kısıtlama ise; bu süreçte, reaksiyona girebilecek potansiyele sahip yeni bileşiklerin ortaya çıkmasıdır. Diğer sıkça rastlanan kısıtlamalar ise; ifade edilen heterolog proteinin proteolize uğramaması, düzgün şekilde katlanması, gerekli bağlanmaların gerçekleşmesi, prostetik grubun eklenmesi, uygun şekilde konumlanması, ilgili mikroorganizmanın gerekli tüm sübstratlara erişimi ve engelleyici bir çevreye maruz kalmaması gibi gereksinimlerdir. Bailey'nin yapmış olduğu ilk metabolik mühendislik tanımı, mikrobiyal stres toleransının iyileştirilmesi gibi çalışmaları kapsamıyor izlenimi vermekteydi. Bu sebeple 1998 yılında Stephanopoulos, eski tanımın "hücresel aktiviteleri" kısmını "ürün oluşumu veya hücresel özellikler" olarak değiştirerek, daha kapsamlı bir metabolik mühendislik tanımı yaptı. Rasyonel metabolik mühendislik, iyileştirilmesi istenilen mikroorganizma hakkında detaylı biyokimyasal, genetik ve regülasyon verisi gerektirdiğinden; bu durum, özellikle hakkında fazla bilgi sahibi olunmayan, ve/veya iyileştirilmesi istenilen özelliklerinin moleküler altyapısı oldukça karmaşık olan mikroorganizmalar için uygulamada ciddi kısıtlamalara neden olabilmektedir. Bu kısıtlamaları aşmak için yine Bailey tarafından 1996'da tanımlanan tersine metabolik mühendislik yaklaşımı ise, rasyonel metabolik mühendisliğin tersten uygulanması niteliğinde olup, iyileştirilmek istenilen mikroorganizma hakkında kapsamlı bilgi sahibi olmayı gerektirmemesiyle araştırmacılara avantaj sağlamaktadır. Tersine metabolik mühendislik yaklaşımı, öncelikle heterolog bir organizmada veya ilgili bir model sistemde istenilen fenotipi tanımlamak ya da oluşturmak, ikinci olarak bu istenilen fenotip için gerekli genetik ve çevresel faktörleri tanımlamak veya ortaya çıkarmak ve son olarak da istenilen fenotipi istenilen organizmaya aktararak uygulamayı kapsar. Bu çalışmanın amacı; bir tersine metabolik mühendislik stratejisi olan evrimsel mühendislik ile daha önce elde edilmiş olan, demire dirençli Saccharomyces cerevisiae mutant mayasının moleküler ve fizyolojik yönden karakterize edilmesi ve böylelikle demir direncinin karmaşık moleküler altyapısının incelenmesidir. Bu amaçla, demire dirençli suşun diğer stres türlerine (özellikle de diğer geçiş metal iyonlarına) karşı çapraz direnci detaylı olarak belirlenmiştir. Fizyolojik analizler de gerçekleştirilmiş ve demire dirençli mutantın yüksek düzeyde gliserol ürettiği ve yine yüksek düzeyde trehaloz biriktirdiği gözlenmiştir. S. cerevisiae mayasının toksik metal stresi varlığında iki ana direnç mekanizması ile hayatta kalabildiği bilinmektedir: ayırma/uzaklaştırma ve kaçınma. Dirençli suşun temel demir direnç mekanizması hakkında bilgi edinmek amacıyla; Alevli Atomik Absorpsiyon Spektrofotometri (F-AAS) yöntemi ile, demir stresi varlığında ve yokluğunda mutant suşun ve referans suşun demir içerikleri belirlenmiştir. Sonuçlar, ortamda demir stresi yokken, demire dirençli maya suşunun, referans suşa kıyasla anlamlı ölçüde daha yüksek demir düzeyine sahip olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, demir stresi varlığında, demire dirençli mutant, referans suş kadar yüksek düzeyde demir iyonunu bünyesine almamıştır. Bu bulgular; demir stresi varlığında, demire dirençli mutantın demir iyonlarının hücre içine taşınımından kaçınarak hayatta kalabildiğine işaret etmektedir. Demire dirençli S. cerevisiae suşunun moleküler karakterizasyonu için, kantitatif Revers Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR) ve mikroarray yöntemleri kullanılarak, demir stresi varlığında ve yokluğunda transkriptomik analizler gerçekleştirilmiştir. Mikroarray analiz sonuçları; demire dirençli S. cerevisiae suşunun oksidatif stres ile ilişkili genlerinin anlatım düzeylerinin, demir stresi yokluğunda bile, referans suşa kıyasla daha yüksek düzeyde olduğunu göstermiştir. Mikroarray analiz sonuçları doğrultusunda, lipid peroksidasyon testi ve hücre içi reaktif oksijen türü (ROS) düzeyi tespit testi gerçekleştirilmiştir. Demire dirençli suşun hücre içi ROS düzeyinin referans suşa göre daha düşük düzeyde olduğu görülmüştür. Buna göre, demire dirençli suş muhtemelen oksidatif stres ile ilişkili genlerinin anlatım düzeylerini yüksek tutarak antioksidan maddeler üretmekte, böylelikle hücre içi ROS düzeylerini düşürmekte ve yüksek düzeyde demir stresi varlığında hayatta kalabilmektedir.