Helicobacter pylori enfeksiyonlarının doğru klinik tanısı için virülans faktörleri ile T hücreye bağımlı bağışıklığın çoklu-PZT ile taranması ve biyoinformatik modellemesi

Helicobacter pylori dünya nüfusunun yarısından fazlasında, yaşamlarının bir döneminde görülen kronik mide enfeksiyonlarına yol açan bir bakteridir. H. pylori gram negatif, mikroaerofilik, spiral şeklinde bir bakteridir ve yaklaşık olarak 3 mikrometre uzunluğunda olup, 0.5 mikrometre çapında 2 ile 6 mikrometre arasında değişen hareket etmesine yardımcı olan kamçılara sahiptir. Çocukluk çağında kazanılan H. pylori enfeksiyonu ömür boyu sürmektedir. H. pylori ile enfekte olan bireylerin büyük çoğunluğu hastalık belirtisi göstermezken, bakterinin enfekte ettiği kişilerin % 20'sinde kronik gastrit, peptik ülser, mukoza ile ilişkili lenfoid doku lenfoması (MALT) ve mide adenokarsinomunda etiyolojik etken olduğu yönünde önemli bulgular vardır. Bakterinin prevalansı, gelişmekte olan ülkelerde gelişmiş ülkere kıyas ile daha yüksektir. Ülkemizde ise erişkin toplumun yaklaşık % 70-80 kadarında bulunur. Bakterinin tam olarak bulaş yolu bilinmemekle beraber fekal-oral ya da oral-oral yollar ile bulaş olabildiği düşünülmektedir. H. pylori enfeksiyonunun tanısı genellikle dispeptik belirtilerin varlığı ve H. pylori enfeksiyonunu gösteren invaziv ve invaziv olmayan bazı testler yapılması sonucunda konur. Enfeksiyon tedavisi için kullanılan standart H. pylori antibiyotikleri ile proton pompası inhibitörlerinin yanı sıra son yıllarda hızla gelişen ilaç direnci H. pylori enfeksiyonunun tedavisi için farklı ilaç kombinasyonlarının uygulanmasını gerektirmiştir. H. pylori enfeksiyonu sonucu oluşabilecek klinik tablolar bakterinin virülans faktörleri, konağın genetik faktörleri ve bağışıklık yanıtı ile yakın ilişki içerisindedir. H. pylori'nin virülans faktörleri bakterinin neden olduğu yangıya, doğal bağışıklık hücrelerini uyarmak, epitel hücrelerindeki doku homeostazisini korumak ya da konağın sinyal yolakları etkilemek gibi farklı mekanizmalar yardımı ile yol açmaktadır. cagA (sitotoksinle ilişkili A geni), vacA (vaküol oluşturucu sitotoksin geni), babA (epitel hücrelerde fukosillenmiş Lewis B antijenlerine bağlanan adezin proteinini kodlayan gen), oipA (dış zar enflamatuar A proteinini kodlayan gen), hpaA (hücreye bağlanmayı güçlendiren, hücre saldırısını kontrol eden adezin genleri), ure A ve ureB (üreaz enzimini kodlayan genler), dupA (duodenal ülser yönlendirici gen), napA (nötrofil aktive edici gen) H. pylori'nin mide mukozasına tutunmasında, kolonize olmasında ve mide de enfeksiyona neden olmasında etkili olan en önemli virülans faktörleridir. H. pylori'nin virülans faktörlerinin yanı sıra konağın H. pylori enfeksiyonuna karşı oluşturduğu bağışıklık yanıtı da enfeksiyonun doğuracağı klinik tablolar açısından oldukça önemlidir. T hücreleri, hücresel bağışıklık yanıtının parçası olup H. pylori enfeksiyonundan korunmada önemli göreve sahiptirler. Gelişimleri timusta gerçekleşir ve sonrasında periferdeki sekonder lenfoid organlara göç ederler. T hücreleri, CD8+ sitotoksik T hücreleri, CD4+ yardımcı T hücreleri ve düzenleyici T hücreleri (CD4+CD25+ Treg) olmak üzere üç gruba ayrılmaktadır. Yardımcı T hücreleri konağın gösterdiği bağışıklık yanıtında aracı hücrelerdir. Yardımcı T hücreleri T yardımcı 1 (Th1), T yardımcı 2 (Th2) ve T yardımcı 17 (Th17), T yardımcı 9 (Th9) ve T yardımcı 22 (Th22) olarak adlandırılan beş ayrı yardımcı T hücrelerine farklılaşmaktadır. Th1 hücreleri kaynaklı bağışıklık yanıtı hücre içi patojenlere karşı korumada rol almaktadır. Th2 hücreleri, hücre dışı parazitlere karşı oluşturulacak bağışıklık yanıtında görevlidir. Th1 ve Th2 hücrelerinden farklı olan ve yakın zaman önce tanımlanan Th17 hücreleri ise hücre dışı mikroorganizmalara karşı konak savunma mekanizmalarından sorumludur. Th9 hücrelerinin patolojik rolü çok açık olmamakla birlikte, pro-inflamatuar Th17 hücrelerinin yol açmış olduğu bağışıklık yanıtını arttırdığı ve T hücre toleransını aracı olarak kullanarak allograft reddini önleyebildiği gösterilmiştir. Th22 hücreleri mikrobiyal patojenlere karşı savunmada, doku onarımı ve doku yenilenmesinde rol almaktadır. Düzenleyici T hücrelerinin (Treg) temel görevi ise bağışıklık yanıtının kontrol altında tutulmasını sağlamaktır. Otoimmün yanıtların oluşmasının engellenmesinde ve enfeksiyon sonrasında patojen mikroorganizma temizliğinde de görev almaktadır. CD4+ T hücrelerinin polarize yanıtları, salgıladıkları sitokin profillerine göre farklılık göstermektedir. Daha önce yapılan bilimsel çalışmalarda T hücreleri ile Helikobakter pilori enfeksiyonu arasındaki ilişki açıkça ortaya konmuştur ve belirtilen T hücre yanıtlarının H. pylori'nin farklı suşlarının içerdiği virülans faktörlerine göre farklılık gösterebileceği öne sürülmüştür. Konağın vücut bağışıklık yanıtına bağlı olarak, Th1 ve Th17 yardımcı hücrelerini kapsayan CD4+ T hücreleri H. pylori ile enfekte olan hastalarda enflamatuvar yanıtta yer almaktadır ve CD4+CD25+ düzenleyici T hücrelerinin miktarı H. pylori ile enfekte olan hastaların mide mukozasında ve periferik kanınında yüksek oranda bulunmaktadır. Fakat H. pylori enfeksiyonunda önemli rolü olan 9 virülans faktörünün; CagA, VacA, OipA, BabA, HpaA, NapA, DupA, UreA, UreB H. pylori ile enfekte olan hastarda görülen T hücre yanıtı ile (Th1, Th17 ve Treg) arasındaki ilişkileri tam olarak bilinmemektedir. Gerçekleştirdiğimiz çalışmamızda, H. pylori enfeksiyonunda önemli olduğu düşünülen dokuz virülans faktörü için geliştirilecek olan çoklu-PZT'nin sonuçları ile H. pylori ile enfekte gastritli ve ülserli hastalarda gelişen T hücre yanıtlarının, Th1, Th17ve Treg, arasındaki ilişkinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya 1 yıl boyunca Acıbadem Hastaneleri Gastroenteroloji Servisi'ne dispepsi yakınmasıyla başvuran ve Endoskopi bölümünde gastroduodenoskopi uygulanan - 18-65 yaş arası, çalışma kriterlerine uygun 18 ülserli, 62 gastritli toplam 80 erişkin hasta dahil edilmiştir. Negatif kontrol olarak ise18 reaktif gastropati tanısı konulan hasta kullanılmıştırdı. Endoskopi yapılan hastalardan antrum küçük kurvaturdan 2 adet, korpus büyük kurvaturdan 2 adet olmak üzere toplamda 4 adet biyopsi örneği alınmıştır. Alınan biyopsi örneklerinin birinden DNA, diğerinden ise RNA izolasyonu yapılmıştır. İzole edilen DNA örnekleri dokuz farklı virülans genini bir arada saptayabilmek için geliştirilmek istenen çoklu-PZT çalışmaları için kullanılmıştır. RNA örnekleri ise T hücre alt gruplarının belirteçleri olan transkripsiyon faktörleri ve sitokinlerin RNA düzeyinde ekspresyonlarının incelenmesi için kullanılmıştır. Virülans faktörleri ve Th1, Th17 ve Treg hücrelerine ait sitokinler ve transkripsiyon faktörlerini belirleyebilmek için primerler tasarlanmıştır. Çalışmaya virülans faktörlerini bir arada saptayabilmek için geliştirilmek istenen çoklu-PZT ile başlanılmış, H. pylori'ye ait olan tüm virülans faktörlerini taşıdığı bilinen G27 suşu pozitif kontrol olarak kullanılarak çoklu PZT için tepkime denemeleri ve optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca sadece ureA ve ureB genlerini tek bir PZT ile saptayabilen bir yöntemde geliştirilmiştir. T hücre alt gruplarının belirteçleri olan transkripsiyon faktörleri ve sitokinler için konvansiyonel PZT ile izlenebilir PZT'de standart eğriyi belirleyebilmek için pozitif hasta grupları bulunmuş ve optimizasyon çalışmaları tamamlanmıştır. Optimize edilmiş izlenebilir PZT ile içerisinde 62 gastritli ve 18 ülserli hasta grubunun bulunduğu 80 hasta için Th1, Th17 ve Treg hücrelerinin gruplarının belirteçleri olan transkripsiyon faktörleri (RORɣT, FOXP3) ve sitokinlerin (IFNɣ, IL-17) RNA düzeyinde ekspresyonları izlenebilir PZT ile incelenmiştir. Çoklu-PZT optimizasyon çalışmaları sonucunda 9 farklı virülans genini üç farklı PZT karışımı ile saptamak olanaklı hale gelmiştir. ureA, ureB, cag A, hpaA, napA genlerinin bir karışımda, oipA, dupA, vacA genlerini bir karışımda ve babA genini bir karışımda saptamak olanaklı olmuştur. Çalışma sırasında geliştirilen yalnızca ureA ve ureB genini içeren çoklu bir PZT tepkimesi ile çalışma grubundaki hastalara üreaz taraması yapılmıştır. Geliştirilen çoklu üreaz PZT sonuçları ile hasta örneklerine uygulanan hızlı üreaz testi ve patolojik değerlendirme sonuçları arasında karşılaştırma çalışması yapılmıştır. Karşılaştırma çalışmaları sonuçlarına göre çoklu üreaz PZT ve patolojik değerlendirme yöntemlerinin hızlı üreaz test yöntemine göre daha benzer ve duyarlı sonuçlar verdiği belirlenmiştir. Çoklu-PZT sonuçları ve gerçek zamanlı-PZT sonuçları biyoinformatik çalışmalar ile bir araya getirilerek H. pylori enfeksiyonu sonucunda oluşabilecek gastrit ya da ülseri birbirinden ayırabilecek faktörleri birarada gösteren bilgisayar tabanlı modeller oluşturulmuştur. Çoklu-PZT sonuçlarına göre test edilen bütün virülans faktörleri içerisinde napA geni ülserli hastalarda gastritli hastalara göre daha yüksek oranda pozitif bulunmuştur. Ülserli ve gastritli hastalarda DupA virülans faktörü ile IFN-γ arasında, babA virülans faktörü ile IL-17 arasında pozitif ilişki bulunmuştur. Bilgisayar tabanlı modelleri doğrultusunda hastalardan izole edilen H. pylori'nin vacA m1/m2, ureA ve cagA gen durumlarının, enfekte olan hastaların IFN-γ (Th1), IL-17 (Th17) ve FOXP3 (Treg) ekspresyon seviyelerinin bilinmesi ile enfeksiyonun doğuracağı klinik sonuçları önceden tahmin etmek olanaklı hale gelmiştir. Yapılan bu çalışmada H. pylori' ye ait olan 9 virülans faktörü ile Th1, Th17 ve Treg hücre yanıtları arasındaki ilişki gastritli ve ülserli hastalarda açıkça ortaya konmuştur. Bu çalışma ile literatürde bilindiği üzere ilk defa H. pylori ile enfekte olan hastalardan izole edilen bakteri izolatlarının sahip olduğu virülans faktörleri ile hastaların bağışıklık yanıtı ilişkilendirilerek bilgisayar bazlı modeller kullanarak klinik sonuçlarını önceden tahmin etmek olanaklı hale gelmiştir.