Nadir metabolik hastalıklarda tüm ekzom dizileme verilerinin biyoinformatik analizleri ile fenotipten sorumlu varyantların değerlendirilmesi

Kalıtsal metabolik hastalık kavramı ilk kez 1903 yılında Garrod tarafından ara metabolitlerin metabolik yıkımlarında rol alan enzimlerin fonksiyon bozukluğu sonucu ortaya çıkan genetik geçişli hastalıklar olarak tanımlanmıştır. Daha sonraki yıllarda hücre içerisinde çok değişik süreçlerde yer alan reseptör gibi enzim dışı proteinlerin fonksiyon bozukluğu sonucunda da metabolik hastalıkların oluşabileceği gösterilmiştir. Şimdiye kadar 700'den fazla kalıtsal metabolik hastalık tanımlanmış olup her geçen yıl yeni metabolik hastalıklar tanımlanmaktadır. İnsan genomunda ortalama 22.000 gen olduğu düşünüldüğünde, ilerleyen yıllarda kalıtsal metabolik hastalıkların sayısı yanında tanımında da değişiklikler olacaktır. Nitekim son yıllarda hücre içinde DNA ürünü proteinin fenotipe etkisi ile ilgili hücresel süreçlerin omiks teknolojileri ile değerlendirilmesi sonucunda metabolik hastalıklara klinik ve moleküler temelli bakış açısı tamamen değişmiştir. Metabolik hastalıklarda hücre içindeki kompartmanlar arası bilgi akışının nicel ve nitel olarak değerlendirilmesi, kurallarının belirlenmesi başta kalıtsal metabolik hastalıklar olmak üzere enfeksiyon hastalıklar gibi edinsel hastalıkların da tanı, tedavi ve izleminde yer alan geleneksel yaklaşımları kökten değiştirecektir. Metabolik hastalıklar patofizyolojik olarak intoksikasyon tipi (aminoasit metabolizması bozuklukları, galaktozemi vb.), enerji metabolizması bozuklukları (mitokondriyal hastalıklar) ve makromolekül hastalıkları (organel fonksiyon bozuklukları) olarak 3 grupta incelenir. İntoksikasyon tipi metabolik hastalıklarda enzim eksikliğine bağlı olarak enzim reaksiyonunun proksimalinde yer alan substratın birikimi ile gelişen toksik etki söz konusu iken, enerji metabolizması bozuklukları ATP molekülünün sentezinde rol alan enzim eksiklikleri sonucu gelişir (PDH eksikliği, Krebs döngüsü enzim eksiklikleri ve solunum zincir fonksiyon bozukluğu vs). Kompleks molekül hastalıkları genel olarak mitokondri dışındaki lizozom, perosizom, endoplazmik retikulum-Golgi cisimciği düzeneğinde rol alan enzim eksiklikleri sonucu gelişir. Lizozomal depo hastalıkları, peroksizomal hastalıklar ve kalıtsal gilkolizasyon bozuklukları bu grup hastalıkların klasik örneklerini oluşturur. Bununla birlikte bizim de içerisinde bulunduğumuz araştırma gruplarının yaptığı çalışmalar sonucunda veziküler trafik bozuklukları, otofaji fonksiyon bozuklukları gibi yeni hastalık grupları tanımlanmaya başlamıştır. Klinik fenotip olarak kalıtsal metabolik hastalıklar, hastalık tipine göre tekli ya da çoklu organ/sistem tutulumu ile kendini gösterir. Santral sinir sistemi metabolik hastalıklarda en sık tutulum gösteren sistemlerin başında gelir (>%55). Bu nedenle kalıtsal metabolik hastalıklarda erken tanı ve tedavinin gerçekleştirilmesi, bu hastalıklarda mortalite ve morbiditenin önlenmesi açısından çok önemlidir. Son yıllarda özellikle geleneksel yöntemlerle tanı konulamayan nadir ya da çok nadir metabolik hastalıkların tanısında ileri düzey genetik analiz yöntemlerinin kullanımı temel yaklaşım olmuştur. Özellikle tüm kodlayıcı gen bölgelerinin analizine olanak veren tüm ekzom dizi analizi yöntemi yeni hastalık genlerinin tanımlanması veya genetik heterojenite gösteren metabolik/nörometabolik hastalıkların moleküler tanısında en önemli araç haline gelmiştir. Ekzom analizleri yeni aday genlerin keşiflerine de ivme kazandırmıştır. Ekzom analizleri ile saptanan genlerin herhangi bir klinik fenotip ile ilişkilendirilmemesi durumunda yeni aday genler karşımıza çıkmaktadır. Bu süreç ister tüm genom ister tüm ekzom analizi ile olsun araştırmacıların ve giderek tıp pratiğinde klinisyenlerin önüne yorumlanması gereken devasa bir bilgi yığını koymuştur. Bu bilgi yığını içerisinden hastalıktan sorumlu olan tek bir aday genin bulunması süreci, tıp pratiğinin şimdiden en temel çalışma alanı olan biyoinformatik bilim dalını yaratmıştır. Devasa bilgi yığınına fenotip eşliğinde en uygun soruları sormak ve yanıtların en uygun şekilde değerlendirilmesi biyoinfomatiğin temel sürecini oluşturur. Bu nedenle biyoinformatik analize klinik ile ilgili derin fenotip bilgilerinin eşlik etmesi şarttır. Bunun yanında patojenitenin tahminlenmesi, kopya sayısı analizi, protein modelleme, bağlantı analizleri vb. gibi in siliko analiz metodları hastalıktan sorumlu tek bir aday genin belirlenmesi sürecinde biyoinformatik analizi yapan araştırmacıya kılavuzluk eder. Biyoinformatik analizler ham verinin işlenmesi sürecinde, aday genlerin belirlenmesi, genetik varyasyonların tespiti ve filtrelenmesi ile patojenik mutasyonların saptanmasındaki en kritik basamaktır. Verinin ileri düzey biyoinformatik analizi ile farklı mutasyon tipleri (yanlış anlamlı, anlamsız, kırpılma, küçük insersiyon/delesyon tipi mutasyonlar) saptanabilirken büyük boyutlardaki kopya sayısı değişiklikleri de belirlenebilmektedir. Bu doktora tez çalışmasında Tüm Ekzom Dizileme verilerinin biyoinformatik analizi için birden fazla yazılım kullanılmıştır. FASTQ verilerinin hizalanmasında (alignment) BWA (Burrows-Wheeler Aligner), Tekrar dizilerinin elenmesi için SAMtools, ekzonik bölgelerin okuma derinliklerinin hesaplanması için BEDtools ve varyant çağırma basamakları için GATK yazılımları kullanılmıştır. Yeniden analiz edilen ham veriler ve kopya sayısı değişikliği (CNV) tespiti için CLC Genomics Server 24.0.1 yazılımından yararlanılmıştır. Yanlış anlamlı mutasyonların PDB dosyaları kullanılarak modellenmesinden önce PDB yapılarının onarılması için FoldX yazılımı kullanılmıştır. Yapılan in-silico protein modellemelerinde ΔΔG değerlerinin hesaplanması için dört farklı yazılım kullanılmıştır (DynaMut2 PremPS INPS-3D ve FoldX). Bulunan varyantlara ait genlerin ve saptanan literatürde bildirilmemiş yeni genlerin birbirleri ile olan etkileşimlerini yansıtan bağlantı analizleri (Network analysis) STRING 12.0 yazılımı ile gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada biyoinformatik yöntemlerle 162 aileden 213 bireye ait Tüm Ekzom Dizileme verisinin ham veri analizleri gerçekleştirilmiş ve elde edilen sonuçlar yorumlanmıştır. 155 olguya kesin tanı konulmuştur ve toplamda ulaşılan varyant sayısı 170 olarak hesaplanmıştır. Kesin tanıya ulaşılan vakaların 103'ünde yanlış anlamlı mutasyon (%61), 18'inde çerçeve kayması mutasyonu (%10), 17'sinde anlamsız mutasyon (%10), 17'sinde kırpılma mutasyonu (%10), 6'sında kopya sayısı değişikliği (%4), 5'inde başlangıç kodonu mutasyonu (%3), 4'ünde ise in-frame delesyon veya insersiyon (%2) tespit edilmiştir. Belirlenen 103 yanlış anlamlı mutasyon dört farklı yöntem ile protein yapısı üzerinde modellenmiş ve in-silico tahminlemeler gerçekleştirilerek mutasyonun protein yapısı üzerinde oluşturduğu yapısal değişiklikler şematize edilmiştir. Saptanan varyantlar, gen düzeyinde bağlantı analizine tabi tutularak nadir kalıtsal metabolik hastalık grubundaki moleküler yolaklar arasındaki ilişkiler tespit edilmiş, belirlenen yeni genlerin bu yolaklar içerisinde ne şekilde konumlandığı araştırılmıştır. Bu tez çalışmasında toplamda 162 aileden 213 bireyde gerçekleştirilen WES analizi sonucunda hastaların 155'ine moleküler tanı konulmuş, 58 vaka ise sonuçsuz kalmıştır. Buna göre yapılan biyoinformatik analizlerde başarılı moleküler tanı oranı %73 olarak hesaplanmıştır. Tüm Ekzom Dizileme verisinin elde edilmesinde kullanılan laboratuvar yöntemleri ve dizileme tekniklerinin son derece gelişmiş olmasına karşın doğru ve kapsamlı biyoinformatik analizlerin yapılması, klinik yorumlamada son derece önemlidir.