Schizochytrium sp. S31'in üretim koşullarının iyileştirilmesi ve rastlantısal mutasyon ile geliştirilmesiyle yüksek oranda lipid eldesi

Schizochytrium sp. yüksek oranda çoklu doymamış yağ asitleri özellikle dokosaheksaenoik asit (DHA) elde etmek amacıyla yaygın olarak çalışılan mikroalgdir. Farmasötik hammadde, gıda katkısı, su kültürü ve hayvan yemi olarak kullanılan çeşitli biyoaktif bileşikler içerirler. Ayrıca alternatif enerji kaynağı olarak kullanılan biyoyakıt üretiminde önemli role sahiptir. Hızlı büyüyen ve yüksek DHA oranına sahip Schizochytrium sp. balık yağına alternatif olarak kullanılabilir. Bu çalışmada, Schizochytrium sp. S31 mikroalginin toplam biyokütle ve yağ oranını artırmak amacıyla hücre büyüme koşullarının tepki yüzey metodu ile optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Optimize edilen büyüme koşulları kullanılarak Schizochytrium sp. S31'in büyük hacimde üretimi gerçekleştirilmiş ve yüksek oranda yağ elde etmek amacıyla hücre parçalama, kurutma ve yağ ekstraksiyonu içeren akış proseslerinin karşılaştırılması ve optimizasyonu tamamlanmıştır. Son bölümde, ultraviyole (UV) ışın veya kimyasal mutajen kullanarak rastlantısal mutasyon uygulaması ve floresan sitometri yöntemiyle yüksek oranda yağ üreten Schizochytrium sp. mutantın seçilimi gerçekleştirilmiştir. Schizochytrium sp. üretimini besiyeri içeriği, pH, tuzluluk ve sıcaklık gibi birçok faktör etkileyebilir. Çoklu doymamış yağ asitlerinin insan sağlığı, endüstriyel ve ticari kullanımında önemli bir rol oynamasından dolayı biyokütle ve lipid üretiminin geliştirilmesi üzerindeki çalışmalar son zamanda artmıştır. Bu sebeple, besiyeri içeriği ve çevresel koşulların optimizasyonu, organizmanın biyokütlesinin ve toplam lipid içeriğinin geliştirilmesi için önemlidir. İstatistiksel yaklaşımlar, biyokütle üretim ve yağ ekstraksiyon optimizasyonu için uygun bir yol olmakla birlikte ürün verimliliğini artırarak üretim maliyetini düşürmüştür. Plackett burman ve merkezi kompozit tasarım gibi istatistiksel metotlar, çeşitli faktörleri ve onların birbiriyle etkileşiminin optimizasyonunda yaygın olarak kullanılmıştır. Plackett Burman tasarımı, biyoproseslerin optimizasyonunda belirlenen cevaplara etki eden faktörlerin tanımlanmasında ilk adım olarak kullanılır. En önemli faktörlerin seçimini takiben merkezi kompozit tasarımlı tepki yüzey yöntemi, bu faktörlerin optimum değerlerini tespit etmek amacıyla kullanılır. İstatistiksel analiz sonuçlarına göre, maksimum biyokütle (26.86g/L) üretimi, 2.29 g/l monosodyum glutamat (MSG), pH 5.8 yetiştirme koşulları ile elde edilmiştir. Maksimum lipid (% 35) üretimi 0.49 g.L-1 MSG, 17.6 °C sıcaklık koşullarında elde edilmiştir. Schizochytrium sp. S31, şeker, organik asitler ve alkol gibi alternatif hammaddeler kullanılarak biyoreaktörde heterotrofik olarak üretilebilir. Bu sebeple heterotrof sistemler, alternatif substratlar kullanarak yüksek kalitede büyük ölçekli DHA üretilmesinde uygun maliyetli bir yoldur. Yüksek hacimde heterotrofik üretim teknolojileri, kirlilik riski ve üretim maliyetini düşürmüş, ışık kısıtlaması olmaksızın yüksek oranda proses kontrolü ve yeniden üretilebilirlik sağlamıştır. Birçok durumda, heterotrof mikroalg kültürü ışık kısıtlaması ve kontrol edilebilirliği sayesinde fototrof kültüre göre daha yüksek hücre yoğunluğu ve lipid verimliliği sağlamıştır. Yüksek hacimde üretim sonuçlarına göre, başlangıç üreme hızı 0.312 h-1 olan 65g/l kuru hücre ağırlığı elde edilmiştir. Karbon azot oranı (C/N) 19.32 olarak hesaplanmıştır. Optimize edilen koşulların uygulanması sonucunda kuru hücre ağırlığının %27.5'i oranında lipid elde edilmiştir. 5 litre biyoreaktörde üretilen Schizochytrium sp. kültüründen %30.18 oranında DHA elde edilmiştir. Biyokütle, lipid ve DHA üretim verimlilikleri sırasıyla 0.65 g/l.h, 0.17g/l.h ve 0.053g/l.h olarak hesaplanmıştır. Büyük hacimde üretim tamamlandıktan sonra istenilen ürünün hücre kütlesinden belirli aşamalarla ayrılarak saflaştırılması işlemi gerçekleştirilir. Bu saflaştırma işlemleri hasat alma, su giderme, hücre parçalanması ve lipid ekstraksiyon işlemlerini içermektedir. Mikroalg kültürünün hasadı, biyokütle konsantrasyonunu arttırmak için santrifüj, filtrasyon ve çöktürme yöntemlerini içerir. Kurutma aşaması, su giderme işlemi olarak da bilinir ve hücre peletleri tamamen sudan uzaklaştırılmış olur. Lipid ekstraksiyonun verimliliğini arttırmak ve ayrıca maliyeti düşürmek için hücre peleti kurutma işlemine maruz bırakılır. Hücre parçalanması, lipid ekstraksiyonun veriminde anahtar bir rol oynamaktadır. Sonikasyon, yüksek basınçlı homojenizatörler, öğütme, enzimatik reaksiyonlar ve kimyasal hidroliz mikroalgler için yaygın olarak kullanılan hücre parçalama yöntemleridir. Mikroalg lipid ekstraksiyonu için literatürde farklı türde solvent ve ekstraksiyon yöntemleri kullanılmıştır. Genellikle hekzan, metanol, etanol ve izopropanol lipid ekstraksiyonu için kullanılan solventlerdir. Hücre parçalama ve lipid ekstraksiyon sonuçlarına göre, hekzan ile birlikte uygulanan ultrasonikasyon metodu toplam lipid oranını önemli ölçüde artırmıştır. Sonikasyon metodu uygulanarak toplam lipid oranı 1.4 kat artırılmıştır. Bununla birlikte, geleneksel lipid ekstraksiyon yöntemleri yüksek oranda toksik solvent kullanmaktadır. Süperkritik akışkan ekstraksiyonu genellikle solvent olarak yüksek basınçta karbondioksit kullanarak yüksek seçicilikle lipid ve/veya nutrasötik ürünlerin ekstraksiyonu için kullanılır. Süperkritik akışkan ekstraksiyonun süre, sıcaklık ve basıncın yağ verimi ve %DHA üzerindeki etkisi tepki yüzey metoduyla tespit edilmiştir. Süperkritik akışkan ekstraksiyonu sonuçlarına göre, basınç ve sıcaklık toplam lipid verim ve DHA konsantrasyonu üzerinde önemli etkiye sahiptir (p <0.05). Sabit sıcaklıkta, basınç arttıkça lipid ve DHA verimi artarken sabit basınçta sıcaklık arttıkça lipid ve DHA verimi azalmaktadır. İstatistiksel kontur analizlerine göre, optimum koşullar 425bar basınç, 40.5°C ve 97.5 dakika olarak tespit edilmiştir. SFE koşullarının optimizasyonu sonucu %30.2 yağ verimi elde edilmiştir. Yüksek yağ içeriğine sahip mikroalg mutantlarının flow sitometri yöntemiyle seçilimi, genoma rastlantısal mutasyon tanıtımı ile gerçekleşebilir. Rastlantısal mutasyon için genel olarak iki mutajen uygulanmaktadır: UV radyasyon ve kimyasal mutajen. Her iki yöntemde mikroalgler ile ilgili genetik bilgiye gereksinim duyulmaz. Floresan aktif hücre ayırma, istenilen fenotipte mutant seçiminde yüksek verimlilik sağlamaktadır. Bu çalışma ile Schizochytrium sp. mikroalginin lipid üretiminin artırılmasında UV mutasyonu ve flow sitometre bazlı seçilimin uygulanabilir bir yaklaşım olabileceği gösterilmiştir. Azot (N), fosfor (P) gibi besin kısıtlayıcı ve sıcaklık sınırlayıcı koşullar, Schizochytrium sp.'nin lipid içeriğinde önemli bir artışa sebep olmuştur. Karakterizasyon sonuçlarına göre, 30 saniye UV ışınına maruz kalmış mutantlar yabanıl tipe göre daha hızlı lipid biriktirmektedir. Mutantlar ve yabanıl tip arasındaki lipid biriktirme profili farkını anlayabilmek için sürece bağlı deneyler uygulanmıştır. Sonuçta, toplam yağ oranı Mutant1'de %28.4, Mutant2'de ise %10.8 oranında artmıştır. Gaz kromatografisi kütle spektrometresi analizlerinden elde edilen sonuçlar flow sitometriden elde edilen sonuçlarla tutarlılık göstermekte olup 30 saniye boyunca UV'ye maruz kalmış kültürlerin DHA oranında artış olduğu gözlemlenmiştir. Yabanıl tip ile diğer iki mutant karşılaştırıldığında DHA oranında sırasıyla %17.9 ve %12.1 oranında artış gözlemlenmiştir.