P53-TAD'nin DNA-PK enzimi tarafından fosforilasyonunun incelenmesi

TP53 geni insan kanserlerinde en sık mutasyon rapor edilen genlerden biridir (%30-50). p53'ün hücresel düzeyi, HDM2'ya (Mouse Double Minute 2 Homolog, MDM2'nun insan homoloğu) bağlı olarak düzenlenir. Normal fizyolojik koşullarda TAD, HDM2 proteini ile etkileşir ve p53'ü proteozomal parçalanmaya yönlendirir. TAD'nin Ser15 ve Ser37 amino asit kalıntıları DNA-PK (DNA'ya bağımlı protein kinaz) tarafından fosforilasyona uğrar. Bu fosforilasyon olayı, p53'ün HDM2 ile etkin etkileşimini önler ve böylece p53 stabilize olur. Stabilize olan p53 bir transkripsiyon faktörü olarak çeşitli genlerin aktivasyonunu başlatır. Önceki çalışmalarda, p53'ün TAD domaininde oluşturulan Leu22Gln-Trp23Ser mutasyonunun p53'ün transaktivasyon işlevini farklı derecelerde azalttığı rapor edilmiştir. Ayrıca Phe19'un arjinine mutasyonunun p53'ün transaktivasyon işlevini olumsuz etkilediğide rapor edilmiştir. Rapor edilen bu mutasyonlar, DNA-PK enziminin fosforile ettiği Ser15 ve Ser37 pozisyonlarına yakın bölgede yer almaktadır. Bu çalışmada, p53'ün Leu22Gln-Trp23Ser ve Phe19Ala mutasyonları bölgeye yönlendirilmiş mutagenez ile oluşturularak bu mutasyonların Ser15 ve Ser 37'nin DNA-PK tarafından fosforilasyonuna etkisi western blotlama yöntemi ile Ser15P ve Ser37P için spesifik antikorlar kullanılarak belirlendi. Ser15 fosforilasyonunu vahşi türe kıyasla Phe19Ala mutantının 2,3 kat, Leu22Gln-Trp23Ser mutantının ise 1,6 kat azalttığı belirlendi. Ser37 fosforilasyonunu ise Phe19Ala mutantı vahşi türe kıyasla 1,6 kat, Leu22Gln-Trp23Ser mutantı ise 2,0 kat azaltmıştır. Vahşi tür Ser15 ve Ser37 fosforilasyonu kıyaslandığında ise DNA-PK'nın Ser37'yi 1,9 kat daha hızlı fosforile ettiği tespit edildi. Ayrıca, I-TASSER ile mutantların TAD'de konformasyonel değişime neden olduğu, bu konformasyonel değişimin ise TAD - (DNA-PKcs) etkileşiminin oryantasyonunu değiştirdiği HADDOCK 2.4 ile belirlendi. De novo tasarım verileri, mutantlardaki fosforilasyon azalmasının, mutantların neden olduğu konformasyonel değişim sebebiyle enzim-substrat etkileşiminin oryantasyonunun değişmesi olduğu öngörüldü.