p60-katanin (katna1) gene promoter regulatıon by ELK1

Hücre iskeletinin dinamik elemanlarından biri olan mikrotubuller, mitotik hücrelerde kromozomların ayrılması ve hücre içi taşınımda, nöronlarda ise dallanma ve nöronal morfojenezin oluşumunda görevlidir. Mikrotubuller, α-tubulin ve β-tubulin alt birimlerini içeren protofilamentlerden oluşmaktadır. Tubulin alt birimlerinin filament zincirine aynı yönde ve aynı sıra ile eklenmesi polimerizasyon, zincirden ayrılması ise depolimerizasyon olarak adlandırılır. Mikrotubullerin artı (+) ucunda β-tubulin, eksi (-) ucunda ise α-tubulin bulunur. Tubulin alt birimlerinin yönelimleri sonucu oluşan kutuplaşma, iki uçtaki polimerizasyon ve depolimerizasyon hızında değişikliğe neden olarak mikrotubul dinamiğinin artmasında oldukça önemlidir. Mikrotubul dinamiğine katkı sağlayan bir diğer mekanizma ise mikrotubul kesimidir. Kısa parçalar halinde bulunan mikrotubullerin hareket kabiliyeti uzun mikrotubullerden daha fazladır ve dolayısıyla mikrotubul kesimi hücre içi hareket için büyük önem arz etmektedir. Katanin, spastin ve figdetin; ATP varlığında mikrotubul kesimini gerçekleştiren enzimlerdir ve kesim mekanizmaları açısından farklılık göstermektedirler. Katanin heterodimerik yapıda bulunan bir proteindir. KATNA1 geni tarafından kodlanan enzimatik aktiviteye sahip p60-katanin ve KATNB1 geni tarafından kodlanan düzenleyici etkiye sahip p80-katanin olmak üzere iki alt birimden oluşmaktadır. Mikrotubul kesimi esas olarak AAA bölgesine sahip p60-katanin tarafından yürütülür. Tek başına kesim işlemini gerçekleştirebildiği bilinmekle birlikte, p60-katanin'in enzimatik aktivitesi p80-katanin varlığında artmaktadır. P80-katanin'in bilinen iki bölgesinden biri p60-katanin'e bağlanmada, diğeri ise protein kompleksini sentrozoma yönlendirmede görevlidir. Bu yönlendirme, nöronlarda mikrotubullerin sentrozomdan kesilerek akson boyunca hareket etmesinde ve dallanmada önem taşımaktadır. Elk1; proliferasyon, tümör gelişimi ve nöronal farklılaşma gibi süreçlerde rol oynayan önemli bir transkripsiyon faktörüdür. ETS ailesinin TCF altgrubu üyesi olan Elk1, bazı genlerin anlatımında aktive edici özelliğe sahip iken bazılarında ise baskılayıcı etki gösterir. Bu mekanizmaların, fosforilasyon ve SUMOlanma olarak adlandırılan iki post-translasyonel modifikasyon ile doğrudan ilişkili olduğu bulunmuştur. Ayrıca bu modifikasyonlar, Elk1 transkripsiyon faktörünün hücre içi yerleşiminde de belirleyici etkiye sahiptir. SUMOlanmanın engellenmesi ve fosforilasyon sonucu çekirdeğe yönelimin arttığı saptanmıştır. Bilinen beş temel bölgeden oluşan Elk1 transkripsiyon faktörünün A bölgesi DNA'ya bağlanmadan sorumlu olmakla birlikte transkripsiyonun baskılanmasında önemlidir. Ayrıca çekirdeğe yönelimi ve çekirdekten çıkışı sağlayan motifleri içerir. Baskılamada görevli olan bir diğer bölge ise R bölgesidir. Bu etkinin SUMOlanma sonucu arttığı ve R bölgesindeki 230., 249. ve 254. Lizin amino asitlerinde oluşan mutasyonların SUMOlanmayı inhibe ettiği öne sürülmüştür. B bölgesi üçüncül yapının oluşmasında görevlidir. C bölgesi, 383. amino asit olan serin ve 389. amino asit olan treoninin hücre dışı sinyaller sonucu D bölgesine bağlanan kinazlar tarafından fosforilasyona uğramasıyla transkripsiyon aktivasyonunda rol oynamaktadır. KATNA1, TATA kutusu içermeyen promotöre sahip olmasından dolayı transkripsiyonun başlaması için diğer düzenleyici dizilere ihtiyaç duymaktadır ve Elk1 konsensus dizisine karşılık gelen M3 motifinin TATA kutusu içermeyen promotörlerde yaygın olduğu bulunmuştur. Ayrıca p60-katanin ve Elk1'ın nöronal farklılaşmada önemli görevlere sahip olması KATNA1 gen anlatımının Elk1 transkripsiyon faktörü tarafından düzenlenebileceği ihtimalini öne sürmektedir. Ayrıca kataninin diğer alt birimi olan p80-katanin'i kodlayan KATNB1 ve mikrotubul kesim aktivitesine sahip diğer bir protein olan spastini kodlayan SPG4 gen anlatımlarının da Elk1 tarafından düzenlendiği laboratuvarımızda daha önceden tespit edilmiştir. Mikrotubul kesiminde görevli olan proteinlerin anlatımını sağlayan genlerin düzenlenmesi ve anlatımdaki değişiklikler hücre içi süreçlerde büyük önem taşımaktadır. Özellikle farklılaşmış hücreler olan nöronlarda bu düzenlemeler kritik sonuçlar doğurmaktadır. Bu çalışmada insan nöroblastoma hücreleri kullanılarak Elk1 transkripsiyon faktörünün KATNA1 gen anlatımı üzerindeki düzenleyici etkisi araştırılmıştır. Öncelikle, Elk1'in KATNA1 dizisi üzerindeki bağlanma bölgesi saptanmıştır. Laboratuvarımızda daha önce, lusiferaz deneyleri ile gerçekleştirilen KATNA1 promotör karakterizasyonu sonucu 5' UTR'nin transkripsiyonda kritik öneme sahip olduğu bulunmuştur. Bu yüzden Elk1'in KATNA1 üzerindeki olası bağlanma bölgeleri hem promotör hem de 5' UTR dizilerinde biyoinformatik araçlarla belirlenmiştir. Rekombinant protein ve bağlanma bölgelerini içeren oligonükleotidler kullanılarak EMSA yöntemi ile Elk1'in KATNA1 üzerindeki esas bağlanma bölgesi tespit edilmiştir. Ayrıca bu sonuçlar kromatin immunopresipitasyon deneyleri ile doğrulanmıştır. Elk1'in KATNA1 mRNA düzeyi üzerindeki etkisi kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile araştırılmış ve mRNA düzeyinin arttığı belirlenmiştir. Ancak protein düzeyini araştırmak üzere yapılan lusiferaz, Western blot ve immunositokimya deneylerinde, p60-katanin seviyesinin Elk1'e bağımlı olarak düştüğü saptanmıştır. Ayrıca, Elk1'in SUMOlanmasının KATNA1 üzerindeki etkisini incelemek amacıyla, R bölgesindeki kritik olduğu daha önceden belirtilen üç amino asit mutasyona uğratılarak SUMOlanmanın engellenmesi amaçlanmıştır. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu, lusiferaz, Western blot ve immunositokimya deneyleri sonucunda, yabanıl tip ve mutant Elk1 arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır. Fakat, mutant Elk1'in çekirdeğe yöneliminin arttığını gösteren önceki çalışmaların aksine, hem çekirdek hem de sitoplazmada yerleşim gösterdiği gözlemlenmiştir. Bu yüzden, hem yabanıl tip hem de mutant Elk1'in SUMOlanma miktarı ko-immunopresipitasyon deneyleri ile araştırılmış ve sonuç olarak mutant Elk1'in da SUMOlanma kapasitesine sahip olduğu tespit edilmiştir. TATA kutusu içermeyen promotöre sahip olan genlerin GC içeriğinin daha fazla olduğu bilinmektedir. Bu nedenle KATNA1 promotör ve 5' UTR dizilerinde bulunan CpG adacıkları biyoinformatik araçlar ile araştırılmış ve Elk1 bağlanma bölgesinin de içinde olduğu CpG adacığı saptanmıştır. Dolayısıyla metilasyonun, Elk1 bağlanma kabiliyetini değiştirerek KATNA1 gen anlatımında düzenleyici etkisinin olabileceği düşünülmüştür. Bu nedenle, Elk1 bağlanma bölgesini içeren KATNA1 oligonükleotidi metillendikten sonra hem metillenmiş hem de metillenmemiş oligonükleotidler ve rekombinant protein kullanılarak EMSA deneyi yapılmıştır. Sonuçlar, metilasyonun Elk1'in KATNA1'e olan bağlanma eğilimini azalttığını göstermiştir.