Peptit ve protein-PEG konjugatlarının sentezi ve kütle spektrometrik analizi

Tedavi edici proteinler farmakoloji alanında oldukça fazla kullanılmalarının yanı sıra, bu alanda tedavi edici protein yapılarını içeren hibrit moleküllerin kullanıldığı birçok klinik uygulama da bulunmaktadır. Polietilen glikol (PEG) kullanılarak, sadece tedavi edici proteinler ile değil tedavi edici diğer bir takım biyomoleküller ve ilaçlarla da pegilasyon adı verilen konjugasyon işlemi gerçekleştirilip hibrit moleküller oluşturulmaktadır. Bu çalışmalarda karşılaşılan en büyük zorluklardan biri, pegilasyon işlemi sonucunda elde edilen moleküllerin analiz edilmeleri, bağlanma bölgelerinin ve bağlanma oranlarının doğru şekilde belirlenebilmesidir. Oluşturulan polimer esaslı bu tedavi edici hibrit moleküllerin analizleri ve karakterizasyonları analitik açıdan oldukça zorlu olmaktadır. Bu tez kapsamında hibrit peptit-polimer ve protein-polimer molekülleri sentezlenerek, bu hibrit moleküllerin analizi ve karakterizasyonları için daha kolay ve zaman almayan analitik yöntemlerin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda PEG ile konjugasyona girmesi hedeflenen örnek polipeptit yapıları olarak insan anjiyotensin II ve insan insülini molekülleri kullanılmıştır. Konjugasyon reaksiyonu için farklı molekül ağırlığı dağılımına sahip PEG örnekleri kullanılmıştır. Kullanılan bazı PEG zincirlerinin uç grupları türevlendirilerek farklı reaktif gruplar haline getirilmiştir. Konjugasyon reaksiyonları hem organik çözücü içerikli hem de fizyolojik ortam koşullarında gerçekleştirilmiştir. Son ürün olarak elde edilen hibrit moleküllerin yani konjugatların MALDI-MS sistemi kullanılarak kütle spektrometrik analizleri yapılmıştır. PEG zincirlerinin biyomoleküle bağlanma bölgelerinin ve bağlanma oranlarının direkt belirlenebilmesi amacıyla MALDI-MS/MS yöntemi kullanılmıştır. İnsülinin kullanıldığı büyük yapılı hibrit moleküllerin karakterizasyonu için parçadan-bütüne (bottom-up) proteomik analiz yaklaşımına gidilmiş ve daha sonra MALDI-MS/MS yöntemi ile PEG zincirlerinin bağlanma bölgeleri ve oranları belirlenmiştir. Bu tez çalışması sonucunda, PEG zincirlerinin uç grupları farklı şekillerde modifiye edilebilmiş ve bu PEG zincirleri kullanılarak yapılan konjugasyon reaksiyonlarının başarılı bir şekilde gerçekleştirildiği MALDI-MS yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. PEG zincirlerinin biyomolekül üzerindeki bağlanma bölgelerinin yeri ve oranının belirlenmesi, tez kapsamında geliştirilen örnek hazırlama ve MALDI-MS/MS analiz yöntemleri ile pratik ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilmiştir.