Pichia pastoris'te rekombinant kimozin üretiminin araştırılması

Bu tez çalışması, peynir endüstrisinde sütün pıhtılaştırılması amacıyla kullanılan kimozin enzimini yüksek verimlilikte üreten bir maya klonunun geliştirilmesi ve bazı temel üretim parametrelerinin belirlenmesi amacıyla yapılmıştır. Çalışma kapsamında sığır gen kaynaklı kimozin enziminin Pichia pastoris'te farklı promotorlar kontrolünde, farklı konak hücrelerde rekombinant olarak üretimi gerçekleştirilmiştir. Üretim miktarının arttırılabilmesi amacıyla diploid hücre formlarında, yüksek gen kopyası içeren haploid klonlarda ve şaperon protein overekspresyonu ile enzim üretimi gibi yöntemler denenmiştir. Bu amaçla çalışmanın ilk bölümünde yabanıl tip P. pastoris X33 hücrelerinde yapısal GAP promotoru altında enzim üretimi gerçekleştirilmiştir. Kimozin genini 1 kopya içeren haploid formdaki klon ile erlenmayer ölçeğinde 5.3 IMCU/mL, fermentör ölçeğinde ise 18 IMCU/mL değerlerinde enzim aktivitesi elde edilmiştir. Ancak bu klon ile enzim üretim seviyesi yetersiz kaldığı için verimi arttırabilmek amacıyla diploid formdaki hücreler ile enzim üretimi denenmiştir. Bu amaçla kimozin genini 1 kopya içeren okzotrof GS115(his4) ve JC220(ade1) konakçılarının eşleşme ile diploid formu oluşturulmuş ve bu formunda erlenmayer ölçekli üretimde 3 IMCU/mL enzim aktivitesi tespit edilmiş, fermentör üretimi denenmemiştir. Diploid formdaki bu hücrede haploid X33 hücrelerine göre daha düşük seviyede enzim üretimi görülmüştür. Sanayi boyutlu üretimlerde besleme prosesi açısından (ucuz besin kaynağı olan glukoz ile besleme) kolaylık sağlaması amacıyla çalışmanın bu kısmında yapısal GAP promotoru tercih edilmiş ancak düşük verimlilikten dolayı çalışmanın devamında promotor değişikliği yapılmıştır. Çalışmanın ikinci bölümünde yapısal GAP promotoruna göre daha güçlü olduğu bilinen, etanol ile indüklenen sentetik ADH2SNT5 promotoru kullanılmış, P. pastoris KM71 hücrelerinde enzim üretimi yapılmıştır. Erlenmayer ölçeğinde gerçekleştirilen üretimler sonucu 18 IMCU/mL civarında enzim aktivitesi elde edilmiş, fermentör ölçeğinde ise bu değer 45 IMCU/mL seviyesine ulaşmıştır. Ancak elde edilen bu değerin arttırılabilmesi amacıyla çalışmanın bir sonraki bölümünde kimozin genini yüksek kopya sayıda içeren çoklu kopyalı kimozin klonları oluşturulmuştur. Çoklu kopyalı kimozin klonlarının elde edilmesi amacıyla çalışmanın üçüncü bölümünde in vitro koşullarda sentetik ADH2SNT5 promotoru kontrolünde 4 kopyaya kadar sığır kimozini içeren P. pastoris KM71 klonları oluşturulmuştur. Oluşturulan bu klonlarda erlenmayer ölçeğinde gerçekleşen üretimlerde en yüksek enzim aktivitesi 6.3 IMCU/mL değeri ile 2 kopya kimozin geni içeren klonda tespit edilmiştir. Beklenenin aksine kimozin genini 2 kopya içeren klonda 1 kopyaya göre artış gözlemlenmişken daha yüksek kopyalarda ise azalma görülmüştür. Oluşturulan klonlarda kimozin gen kopya sayısının artması ile üretilen enzim miktarı artsa da enzimin hücre dışına sekresyonunun tam olarak sağlanamadığı düşünülmektedir. Bu amaçla çalışmanın dördüncü bölümünde enzim üretim miktarının arttırılabilmesi amacıyla yüksek kopyalı kimozin klonlarında, PDI şaperon proteininin ekstra 2 gen kopya sayısına kadar overekspresyonu sağlanmış ve protein üretim miktarlarına etkisi incelenmiştir. PDI overekspresyonu ile oluşturulan klonlar arasında erlenmayer ölçeğinde gerçekleştirilen üretimlerde en yüksek enzim aktivitesinin 8.2 IMCU/mL değeri ile 2 kopya kimozin ve 2 kopya PDI içeren klonda tespit edildiği görülmüştür. Bu klonlar ile fermentör ölçekli gerçekleştirilen üretimlerde ise elde edilen enzim aktivite değerleri 2 kopya kimozin içeren klonda 20 IMCU/mL seviyesinde iken 2 kopya kimozin+2 kopya PDI geni içeren klonda 39 IMCU/mL seviyesine ulaşmıştır. PDI overekspresyonu ile aynı klonun enzim aktivite değeri yaklaşık 2 kat arttırılmış olmasına rağmen hedeflenen üretim yakalanamamıştır. Çalışma kapsamında oluşturulan tüm klonlar arasında fermentör ölçeğinde 28°C ve pH 3 şartlarında gerçekleştirilen üretimlerde en yüksek enzim aktivitesi, 45 IMCU/mL değeri ile ikinci bölümde oluşturulan pADH2SNT5HIS4-BtCHY-C#12 (KM71) klonunda tespit edilmiştir. Bu klonda enzim aktivite değerinin arttırılması amacıyla farklı sıcaklık ve pH değerlerinde üretimler yapılmıştır. Denenen farklı sıcaklık ve pH'lar arasında en yüksek enzim aktivitesinin 75 IMCU/mL ile 24°C ve pH 4'te elde edildiği görülmüştür. Bu sebeple en yüksek enzim aktivitesini gösteren bu aday klon ile sanayi boyutlu üretim için fermentör ölçeğinde sıcaklık ve pH gibi bazı parametreleri belirlenmiş olan bir üretim prosesi geliştirilmiştir.